来自海洋的亚罗酵母fa2-3及其所产低温淀粉酶与产酶方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域海泥的亚罗酵 母sp. )FA2-3 ;本发明还涉及该菌株产低温淀粉酶的方法及产品。
【背景技术】
[0002] 淀粉酶（Amylase)是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群 酶的总称，广泛存在于动植物和微生物中，并广泛应用于造纸、食品、医药工业和洗涤剂工 业。普通淀粉酶和高温淀粉酶在淀粉水解工艺处理中温度较高、原料容易变质，制约了淀粉 酶的进一步应用。低温酶（Coldtemperature-enzyme)是指在低温条件下能有效催化生化 反应的一类酶，最适反应温度比普通酶要低20~30°C，而且在0°C有一定的活性。低温淀 粉酶酶促作用温度低，在不加热的情况下就可以保证较高的催化效率。另外，在生产中由于 低温淀粉酶对热敏感，所以可以通过较低温度的热处理就可以使酶失活，节约了能源。
[0003] 低温淀粉酶的特殊性质使其在工业生产应用中具有一定的优势，食品行业是低温 淀粉酶的一个重要应用领域，很多风味物质为保持其风味不丢失，常常需要在低温条件下 发酵。0-20 °C温度范围内（此时同源的嗜温型酶不活泼），低温微生物具有高生长速率、高 酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热等系统，因此在节能 方面有相当大的优势。与此同时低温发酵还能够减少中温菌的污染的危险，尤其是在连续 发酵操作中。
[0004] 环境治理是低温酶又一个应用领域，在低温条件下来自低温微生物的淀粉酶催化 速度较嗜温型淀粉酶更快，低温微生物及其产生的淀粉酶还可替代化学方法，这些特点可 以使废水处理费用降到最低程度。另外在一些季节性变化幅度大的地区，温度变化很大，这 就使微生物分解有机污染物如大分子碳水化合物和类脂的效率降低。将能够分泌低温淀粉 酶等酶类的低温微生物接种到这种环境里去，则有助于提高对难处理化学物质的生物降解 能力。这些微生物具有高催化活性酶及它们在较低温度下的特殊专一性，使得低温微生物 及其产生的低温淀粉酶成为生物治理的理想工具。另外，由于低温淀粉酶在0-20°C的温度 范围内具有高活性的特点，因此，其在饲料、纺织和洗涤工业的应用方面同样具有较大的潜 力。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产低温淀粉 酶的来自海洋的亚罗酵母FA2-3。
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述来自海洋的亚罗酵母FA2-3产低 温淀粉酶的方法及其所产低温淀粉酶。
[0007] 本发明的特征包括来自海洋的亚罗酵母（7arroriasp. )FA2-3菌株本身（以下称 菌株FA2-3)，以及利用该菌株发酵生产低温淀粉酶的方法。
[0008] 本发明所涉及的菌株FA2-3是在中国江苏省连云港海域的海泥中分离到的菌株， 该菌株已于2015年1月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCCNo. 10377;保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研宄所，电话：〇1〇_64807355。
[0009] 以下对本发明进行详细的阐述。
[0010] 一、本发明菌株FA2-3的形态特征与生理生化特征。
[0011] 1.1形态特征： 菌株FA2-3为长椭圆形，单个分散，出芽生殖（见图1)。菌落呈白色，边缘整齐。
[0012] 1. 2菌株FA2-3的序列的扩增和分析： 用酵母基因组DNA提取试剂盒提取得到FA2-3的基因组，ISSrDNA序列扩增引物，扩增 大小约 1.8k，NS1 5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3，NS8 5-TCCGCAGGITCACCTACGGA-3。反应总 体系-30ul，PCRmix(26yL)，上下游引物(各lyL)，DNA模板（2yL)。反应程序：95°C变 性 4min;94°C变性 20S，55-60°C退火 45S，72°C延伸 120S，35 个循环；72°C2min。将PCR电 泳纯化回收并构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至南京思普金生物科技有限公司测 序，将测得序列互补反相拼接后，获得的1441bp碱基片段序列，根据测序结果，在NCBI中将 所得序列分别与Genbank数据库中其它酵母菌的18SrDNA序列用BLASTN进行同源性比对， 并构建系统发育树(见图2)，结果发现与亚罗酵母最接近。
[0013] 二、本发明菌株FA2-3的生长特性 本发明提供的菌株FA2-3,对其生长特性进行了细致的研宄，基本摸清不同条件下该菌 的生长情况。
[0014] 2. 1本发明中涉及的培养基： YPD培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，陈海水配制，pH7. 0; 所述的产酶培养基为：马铃薯淀粉〇. 5%，花生柏0. 5%，NaCl0. 5%，pH7. 0。
[0015] 2. 2种子液的制备：将菌株FA2-3斜面种子接种到YH)培养基中，30°C，150r/ min,装液量20%，培养12h。
[0016] 2. 3培养时间对菌株FA2-3生长的影响： 将种子液4%接种至Yro培养基中，30°C，150r/min培养48h，每隔4h取一次样，于0D_ 下测定其菌浓度。菌株8h进入对数期，在20h进入稳定期，见图3。
[0017] 2. 4温度对菌株FA2-3生长的影响： 分别在不同温度（15 °C、20°C、25°C、30°C、35°C)下，150r/min培养 12h，测定 0D值。 该菌株生长温度范围为15-35°C，最适生长温度为30°C，见图4。
[0018] 2. 5培养基pH对菌株FA2-3生长的影响： 培养基pH范围4. 0 - 10. 0, 30°C，150r/min培养12h，测定0D值。生长pH范围为5-10， 最适生长pH为7.0,见图5。
[0019] 2. 6NaCl浓度对菌株FA2-3生长的影响： 培养基用自来水配制，NaCl浓度为0%-8%，30°C，150r/min培养12h，测定0D值。菌株 在NaCl浓度为0%-8%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为0. 5%，见图6。
[0020] 三、菌株FA2-3发酵生产低温淀粉酶的方法 发明人对菌株FA2-3发酵生产低温淀粉酶的方法进行了研宄。
[0021] 3. 1培养时间对菌株FA2-3产酶影响： 将种子液以4%的接种量接种至产酶培养基液体培养基内，30°C、150r/min摇床培养 40h，每隔4h取一次样，测定酶活力。产酶时间为20h时间，产酶量达最高，见图7。
[0022] 3. 2温度对菌株FA2-3产酶影响： 在不同温度（15°C、20°C、25°C、30°C、35°C)下培养20h，其余条件同3. 1，分别测酶液的 活力，FA2-3最佳产酶温度为25°C，结果见图8。
[0023] 3. 3培养基pH对菌株FA2-3产酶的影响： 将产酶液体培养基的pH调节至5-10,在25°C、150r/min下振荡培养20h，测酶活，该 菌株在pH5. 0-10. 0范围内产酶良好，最适产酶pH为7. 0,见图9。
[0024] 3. 4NaCl浓度对菌株FA2-3产酶的影响： 培养基用自来水配制，NaCl浓度0%-8%，在最适温度和pH下培养，其余条件同3.1， 测酶活，该菌株在NaCl浓度0%-4%产酶较好，最适产酶NaCl浓度为0. 5%，见图10。
[0025] 3. 5碳源对菌株FA2-3产酶的影响： 0. 5%的碳源(酵母粉，玉米淀粉，蔗糖，麦芽糖，山芋淀粉，马铃薯淀粉，麸皮，糊精，淀粉 糖，甘油，葡萄糖，绿豆淀粉，乳糖)，分别替换产酶培养基中的酵母膏，其余条件同3. 1，测酶 活。结果见表1，酵母菌在以甘油为碳源的培养基中产酶最多，蔗糖次之，葡萄糖和马铃薯淀 粉也能使菌株产酶，从应用角度马铃薯淀粉考虑作为适宜碳源