>[0123]反义链为 5' -CAUAUCACUGUGUUCAAGACC-3'（SEQIDNO. 10);
[0124] siRNA3-MY0Zl：
[0125]正义链为 5' -AAAUAUAGGUCUUGAACACAG-3'（SEQIDNO. 11)，
[0126]反义链为 5' -GUGUUCAAGACCUAUAUUUCC-3'（SEQIDNO. 12)。
[0127] 3、重组腺病毒
[0128] 根据腺病毒介导的siRNA的不同，将细胞分为五组，SH组：不转染任何病毒载体 的SH-SY5Y细胞，作为空白对照；Ad组：感染空腺病毒质粒细胞组，siRNAl-MYOZl组：腺 病毒介导干扰序列1感染细胞组：siRNA2-MY0Zl组：腺病毒介导干扰序列2感染细胞组； siRNA3-MY0Zl组：腺病毒介导干扰序列3感染细胞组。
[0129] 将细胞按IX105/孔接种到6孔细胞培养板中，每孔2ml，在37°C、5%C02培养箱 中细胞培养24h，此时细胞融合密度约为50% -60%;吸出上清弃掉，用无血清培养基lml洗 两遍，用lml无血清培养基稀释的M0I为50的各组腺病毒，每间隔20min摇晃培养板一次， 以增加感染效果，感染48h后，再加入浓度为1000ymol/LMPP+完全培养基，孵育24h后。 收集细胞用于提取RNA;
[0130] 3、QPCR检测MY0Z1基因的转录水平
[0131] 3.1细胞总RNA的提取
[0132]采用TRIzolReagent(InvitrogenCat.No. 15596-018)总RNA提取试剂，按说明 书提供方法提取SH-SY5Y细胞的总RNA。具体方法为：吸去培养液，用PBS清洗一遍，加入适 量TRIzol试剂，六孔板中每孔加入lmL，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以lmL/管分 装至1.5mLEppendorf管中。按400iil氯仿/mlTrizol加入氯仿，用手上下摇动30-50次， 室温放置5min。4°C、12000g离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0? 4mL 异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4°C、7500g离心10min。弃上清，75%乙醇洗涤RNA沉 淀，7500g离心5min，室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测 定。
[0133] 3. 2逆转录步骤同实施例2。
[0134] 3. 3QPCR扩增步骤同实施例2。
[0135] 4、统计学方法
[0136] 实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示，使用 SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰MYOZ1基因表达组与对照组之间的差异采用t 检验，认为当P〈〇. 05时具有统计学意义。
[0137] 5、结果
[0138] 结果如图 2 显示，相比siRNA2-MYOZl、siRNA3-MYOZl，siRNAl-MYOZl能够更有效抑 制MY0Z1基因的表达，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。
[0139] 实施例4MY0Z1基因对神经细胞的影响
[0140] 采用MTT实验检测MY0Z1基因对SH-SY5Y帕金森病细胞模型细胞增殖能力的影 响。
[0141] 1、细胞培养与腺病毒感染步骤同实施例3。
[0142] 2、步骤：调整SH-SY5Y细胞密度至5X104/mL，以每孔100 y1细胞接种于96孔培 养板中，按照实施例3处理细胞，在处理后每隔12h应用MTT检测，直至72h。MTT还原分析法 检测细胞活性：将孔内溶液弃掉，加入100 u1培养基，再每孔加入5mg/mL的MTT液10 y 1， 37°C培养4h后，吸去培养基，每孔加入DMS0100 y 1，室震荡lOmin，使紫蓝色沉淀充分溶 解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值（0D值）。将0D值作为反映SH-SY5Y细胞活性的参 数。本实验重复3次，每次实验中相同条件设5个平行孔。
[0143] 3、统计学方法
[0144] 实验采用3次重复实验，使用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析，两者之间的差 异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0145] 4、结果
[0146] 图3所示的结果显示：siRNAl-MYOZl组的细胞生长速度高于对照组组的细胞生长 速度，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。上述结果表明MY0Z1过表达不利于SH-SY5Y细胞的 生长，通过抑制MY0Z1基因的表达可以促进神经细胞的生长。
[0147] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 人MYOZl基因及其表达产物在制备诊断帕金森病的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MYOZl基因及其表达产物的表达水平以诊断帕金森病 的产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断帕金森病的产品至少 包括一对特异性扩增MYOZl基因的引物；所述用实时定量PCR诊断帕金森病的产品至少包 括一对特异性扩增MYOZl基因的引物；所述用免疫检测诊断帕金森病的产品包括与MYOZl 蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断帕金森病的产品包括与MYOZl基因的核酸序 列杂交的探针；所述用芯片诊断帕金森病的产品包括蛋白质芯片和基因芯片，其中，蛋白质 芯片包括与MYOZl蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MYOZl基因的核酸序列杂交的 探针。4. 人MYOZl基因在高通量测序平台中的应用，其特征在于，通过高通量测序可以获知 MYOZl基因的表达异常与帕金森病的发生发展相关。5. -种诊断帕金森病的产品，其特征在于，所述产品通过检测MYOZl基因的表达来诊 断帕金森病。6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于，该产品包括芯片、试剂盒。其中，所述芯 片包括基因芯片、蛋白质芯片。所述基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的寡核苷 酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MYOZl基因转录水平的针对MYOZl基因的寡核苷 酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体及固定在固相载体上的MYOZl蛋白的特异性抗体。 所述试剂盒所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。所述基因检测试剂盒 包括用于检测基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MYOZl蛋白的特异性抗 体。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对MYOZl基因的引物和 /或探针。8. 人MYOZl基因及其表达产物在制备治疗帕金森病药物中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括：含有人MYOZl基因和/或 其表达产物抑制剂。10. 根据权利要求9所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂是针对MYOZl的siRNA。
【专利摘要】本发明公开了MYOZ1在帕金森病诊断和治疗中的作用，属于基因新用途技术领域。经实验证明，与正常人相比，帕金森病患者血液中的MYOZ1基因表达上调，表明可以通过检测血液中MYOZ1表达量来诊断受试者是否患有帕金森。本发明通过体外MTT实验发现，MYOZ1基因表达不利于人神经母细胞瘤细胞的生长。因此，MYOZ1在制备诊断和治疗帕金森病的产品中，具有良好的开发应用前景。
【IPC分类】A61K31/713, G01N33/68, C12Q1/68, A61K39/00, A61K45/00, A61P35/00, A61K48/00
【公开号】CN104962658
【申请号】CN201510463617
【发明人】杨承刚, 高倩倩
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月31日