Rna活性和血管通透性的调节的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明总体上设及可用于影响祀RNA、尤其是CD册或VE-巧粘蛋白mRNA的活性的 寡核巧酸。更明确地说，本发明的寡核巧酸抑制miR-27a与VE-巧粘蛋白mRNA的结合。本 发明还设及所述寡核巧酸用于抑制血管通透性或血管渗漏并且治疗与此相关的疾病和病 状的用途。
【背景技术】
[0002] 反义寡核巧酸
[0003] 反义寡核巧酸的第一代意在影响祀mRNA的活性。对所述寡核巧酸有兴趣的一个 原因是敏锐并且可预测的特异性的可能性，其可因特定碱基配对而实现。设计对诸如mRNA 等给定核酸具高度特异性的寡核巧酸在理论上是非常简单的。然而，简单碱基配对不足W 实现对给定祀mRNA的调节。换句话说，与给定祀mRNA互补的寡核巧酸未必影响祀mRNA的 活性。如果寡核巧酸祀向mRNA的开放阅读框，那么举例来说可W是翻译设备在翻译期间简 单地置换寡核巧酸。因此，研发了将提高寡核巧酸的调节活性的手段，所述寡核巧酸包括可 活化祀mRNA的RNaseH裂解的寡核巧酸。然而，所述寡核巧酸的一个缺点是它们可介导除 预定祀mRNAW外的RNA裂解，从而产生脱祀效应。尽管如此，通过RNaseH裂解起作用的 若干寡核巧酸仍在临床试验中用于治疗各种疾病。
[0004] 更新近的研究已显示包括哺乳动物细胞的真核细胞包含使用RNA作为特异性决 定子的复杂基因调节系统（RNAi机制）。该个系统可由小干扰性RNA(siRNA)触发，所述小 干扰性RNA可引入所关注的细胞W调节祀mRNA的活性。
[000引当前，对使用siRNA作为新颖治疗剂来触发RNAi机制用于祀RNA、特别是祀mRNA的特定调节作出了大量努力。然而，siRNA证实比最初所想更小的特异性并且产生显著脱 祀效应。现相信该些脱祀归因于siRNA，更精确地说归因于SiRNA的引导链，其充当微RNA。
[0006]微RNA
[0007] 微RNA(miRNA)是一类内源性RNA分子，其像SiRNA那样经由RNAi机制起作用。 miRNA是小、单链、非编码RNA，其至少部分通过其通过经由miRNA的所谓的种子序列或种子 区与miRNA的5' -端碱基配对结合于祀基因的3'UTR的能力来调节mRNA降解与翻译。
[0008] 当前，已发现超过500个人miRNA并且相信所有人类基因中超过=分之一是由 miRNA调节。因此，miRNA本身可用于调节祀RNA的活性，从而开启了发展miRNA作为治疗 剂的可能。然而，miRNA通常在超过一个祀RNA处起作用；它们是混杂的。因此，向细胞中 引入miRNA或调节细胞中的miRNA水平将影响超过一个祀mRNA的活性并且因此可产生出 乎意外并且不需要的效应。
[0009]miRNA可使用称为安提妙（antimir)和安塔够妙（antagomir)的互补寡核巧酸来 抑制。然而，因为每个miRNA本身是混杂的，所W任何给定安提妙或安塔够妙均将类似地影 响超过一个祀mRNA的活性。
[0010]miRNA和血管生成
[0011] 严密控制血管通透性是血管的内皮细胞内层的主要功能之一。内皮的该一屏障功 能的丢失构成许多全身性和器官特异性疾病过程的基础，所述疾病过程包括肿瘤血管的渗 漏、各种呼吸窘迫综合征、化学治疗的并发症W及急性类过敏性反应。对通透性的控制通常 分成两种类型；一种是刺激物，像凝血因子、组胺、血管内皮细胞生长因子（VEGF)，其诱导 渗漏。另一种是像血管生成素-1的一类分子，其对保持现状施加增强性影响。最终，该两 种影响集中于调节接合结构的细胞-细胞接合分子，诸如VE巧粘蛋白和PECAM。
[0012] 鉴于该些刺激物诱导相对明显的表型，令人惊讶的是在修复或生理性血管生成的 情况下渗漏是如此具自限制性。发明人推断可能存在尚未被发现的机制，其将发挥作用W 促使例如在血管生成的过程中快速恢复至血管常态，或其在生理性血管生成期间发挥作用 W限制新形成血管的渗漏。该将与肿瘤新生血管形成鲜明对比，所述肿瘤新生血管W过度 渗漏为特征，其中可能回避了该些控制机制。
[0013] 在脉管系统中，已将miRNA与发育调节W及诸如肿瘤生长和屯、血管疾病等疾病相 联系。举例来说，内皮细胞限制性miRNA即miR-126在血管发育和肿瘤血管生成期间高度 表达，而相比之下在肿瘤血管中miR-101下调，通过组蛋白-甲基转移酶起作用W促进血管 生成。在内皮细胞中miR-296是VEGF响应性的并且此miRNA的阻断抑制肿瘤相关性血管 生成。miR-132在肿瘤新生血管中被诱导，祀向作用于整合蛋白下游W增加细胞增殖和血管 生长的pl20RasGAP。miR-92a祀向整合蛋白信号传导并且其抑制改善了缺血性损伤之后的 血流恢复。
【发明内容】
[0014] 本发明设及用于调节祀RNA活性的寡核巧酸。本发明的寡核巧酸可能够或不能在 结合于祀位点时募集RNaseH和/或RNAi机制。
[00巧]本文公开了包含与SEQIDNO;1中所示的序列互补并且能够与其结合的序列的寡 核巧酸。典型地，寡核巧酸包含与VE-巧粘蛋白（CD册)mRNA分子的3'未翻译区（3'UTR) 的包含SEQIDNO;1中所示的序列的邻近序列互补并且能够与其结合的序列。
[0016] 在本发明的第一方面中提供包含与包含SEQIDNO;2或含1、2或3个取代的SEQ IDNO;2的RNA序列的至少8个连续碱基互补的连续序列的寡核巧酸，其中寡核巧酸抑制 miR-27a、其变体或包含含序列UCACAG的种子区的miRNA结合于所述RNA。
[0017] 典型地，miR-27amiRNA是包含SEQIDNO;11中所示的核巧酸序列的 hsa-miR-27a。
[0018]在一个实施方案中，寡核巧酸包含与SEQIDNO;2或包含1、2或3个取代的SEQ IDNO;2的至少或约7个碱基、至少或约8个碱基、至少或约9个碱基、至少或约10个碱基、 至少或约11个碱基、至少或约12个碱基、至少或约13个碱基、至少或约14个碱基、至少或 约15个碱基、至少或约16个碱基、至少或约17个碱基、至少或约18个碱基、至少或约19 个碱基、至少或约20个碱基、至少或约22个碱基、至少或约25个碱基、至少或约30个碱基 或至少或约35个碱基的序列互补的连续序列。
[0019] 典型地，寡核巧酸结合于SEQIDNO;2的位置22-27。
[0020] 在一个特定实施方案中，寡核巧酸与SEQIDNO;2之间的碱基配对包括SEQID N0;2 的位置8-28、8-27、9-27、10-27、11-27、12-27、13-27、14-27、15-27、16-27、17-27、 18-27、19-27、20-27、21-27、9-28、10-28、11-28、12-28、13-28、14-28、15-28、16-28、17-28、 18-28、19-28、20-28 或 21-28。
[0021] 在另一个特定实施方案中，寡核巧酸包含SEQIDNO;3或SEQIDNO;4中所示的 序列。
[0022] 在另一个特定实施方案中，寡核巧酸包含一个或多个修饰型核碱基。在示例性实 施方案中，修饰型核碱基可选自LNA核碱基、UNA核碱基W及2' 0-甲基核碱基。
[0023] 在另一个特定实施方案中，寡核巧酸包含SEQIDNO;5、SEQIDNO;6或SEQID NO;7中所示的序列。
[0024] 在第二方面中，本发明提供一种包含如权利要求1至8中任一项所述的寡核巧酸 的组合物。
[00巧]在一个实施方案中，组合物是包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀 释剂的药物组合物。
[0026] 在第S方面中，本发明提供用于调节细胞中的VE-巧粘蛋白的活性的方法，所述 方法包括使所述细胞与有效量的第一方面的寡核巧酸接触，从而调节VE-巧粘蛋白的活 性。
[0027] 在特定实施方案中，调节VE-巧粘蛋白的活性抑制或降低血管通透性，治疗或预 防血管通透性相关疾病或病状，抑制肿瘤生长，治疗缺血性损伤，增强从缺血性损伤恢复， 治疗手术创伤和/或促进手术后恢复，或促进或诱导血管生成。
[0028] 在第四方面中，本发明提供一种用于抑制或降低脉管壁血管的血管通透性的方 法，所述方法包括使血管与有效量的第一方面的寡核巧酸或第二方面组合物接触。
[0029] 在第五方面中，本发明提供一种用于抑制或降低需要所述治疗的受试者的血管通 透性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的第一方面的寡核巧酸或第二方面的组合 物。
[0030] 在第六方面中，本发明提供一种用于治疗或预防受试者的血管通透性相关疾病或 病状的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的第一方面的寡核巧酸或第二方面的组合 物。
[0031] 血管通透性相关疾病或病状可选自水肿、屯、血管疾病、屯、肌梗塞、周围性血管疾 病、局部缺血、中风、癌症、动脉粥样硬化、银屑病、糖尿病、诸如类风湿性关节炎等自体免疫 疾病、血小板减少、高空病、气压损伤、医原性病症、细菌感染、病毒感染W及与血管渗漏相 关的眼部病状，诸如非增生性和增生性视网膜病变（包括糖尿病性视网膜病变）、黄斑水肿 (包括糖尿病性黄斑水肿）、青光眼W及黄斑变性（包括年龄相关性黄斑变性）。
[0032] 在特定实施方案中，水肿可W是例如屯、脏水肿、肺水肿、肾水肿、黄斑水肿、脑水 月中、营养不良性水肿或淋己水肿。水肿可由手术程序引起，特别是较大的手术程序，诸如屯、 脏手术、器官移植手术、膝关节和髓关节置换手术、牙科手术或截肢手术（例如与糖尿病并 发症相关）。
[0033] 在第走方面中，本发明提供一种用于治疗或预防受试者的水肿的方法，所述方法 包括向受试者施用有效量的第一方面的寡核巧酸或第二方面的组合物。
[0034] 在第八方面中，本发明提供一种用于抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包 括向受试者施用有效量的第一方面的寡核巧酸或第二方面的组合物。
[00巧]在第九方面中，本发明提供一种用于治疗和/或增强从缺血性损伤恢复的方法， 所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用有效量的第一方面的寡核巧酸或第二方面的 组合物。
[0036] 在第十方面中，本发明提供一种用于促进或诱导受试者的细胞或组织中的血管生 成的方法，所述方法包括向受试者或向由其衍生的细胞或组织施用有效量的第一方面的寡 核巧酸或第二方面的组合物。
[0037] 促进或诱导血管生成可例如用于创伤愈合（包括手术创伤）、组织修复、组织再生 或组织工程改造。血管生成可W是例如手术后血管生成。
[0038] 在第十一方面中，本发明提供一种用于治疗手术创伤和用于促进手术后恢复的方 法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的第一方面的寡核巧酸或第二方面的组合 物。
[0039] 根据第十和第十一方面，手术创伤可W是由手术引起或在手术过程中诱导的任何 创伤，包括例如与牙科手术、屯、脏手术、器官移植手术、膝关节和髓关节置换手术W及截肢 (例如与糖尿病并发症相关）相关的创伤和手术。
[0040] 还提供第一方面的寡核巧酸用于抑制或降低血管通透性，治疗或预防血管通透性 相关疾病或病状，抑制肿瘤生长，治疗和/或增强从缺血性损伤的恢复，或促进或诱导血管 生成。
[0041] 还提供第一方面的寡核巧酸用于制造药剂的用途，所述药剂用于抑制或降低血管 通透性，治疗或预防血管通透性相关疾病或病状，治疗或预防水肿，抑制肿瘤生长，治疗和 /或增强从缺血性损伤恢复，促进或诱导血管生成和/或治疗手术创伤W及促进手术后恢 复。
[0042] 还提供第一方面的寡核巧酸作为研究工具的用途，所述研究工具用于研究例如 VE-巧粘蛋白活性、血管通透性和血管生成W及其可能的治疗和疗法。
【附图说明】
[0043] 本文仅通过非限制性实例参考W下图式描述了本发明的实施方案。
[0044] 图1.勒1向VE-巧粘蛋白的miR-27a。
[0045] (A) 4她后VE-巧粘蛋白在对照或miR-27a模拟物转染的细胞中的表达。0-肌 动蛋白用作上样对照。炬）五个独立HUVEC系的平均值+SEM的归一化表达。*，参照对照 p<0. 05。（C)如通过流式细胞术所评估的表面VE-巧粘蛋白的水平。实线，对照模拟物； 虚线，miR-27a模拟物。显示一次实验的结果（类似于进行了S次）。值）用miR-27a转 染后2化的VE-巧粘蛋白mRNA表达的水平。针对0-肌动蛋白归一化的结果是五个独立 HUVEC系的同样四次qRT-PCR反应的平均值+SEM。*参照对照P< 0. 05。巧）用对照或抗 miR-27a转染的细胞转染后2化的HUVEC的VE-巧粘蛋白表达。（巧示出S个独立HUVEC 系的平均值+SEM。***，参照对照P< 0. 001。佑）如通过流式细胞术评估的表面VE-巧粘 蛋白的水平。实线，对照LNA;虚线，LNA-27。显示一次实验的结果（类似于进行了两次）。 (H)肥K293T细胞W及对照或miR-27a模拟物中的含有含推定的miR-27a结合位点（Wt，黑 色柱）或突变miR-27a结合位点（Mut，白色柱）的VE-巧粘蛋白的3'UTR的巧光素酶构 建体。结果表示四个独立实验的同样S次转染的平均值+SEM。*p= 0. 01，化+miR-27a相 较于Mut+miR-27a。**p= . 00001，Wt+ 对照相较于化+11111?-273。
[0046] 图2.miR-27a改变VE-巧粘蛋白定位和内皮细胞通透性。
[0047] (A)，炬）在转染之后4她将HUVEC针对VE-巧粘蛋白进行染色。（A)对照模拟物 (i)或（ii)miR-27a模拟物炬）（i)对照LNA，（ii)miR-2化NA。比例尺；100ym。似48 小时 之后在对照或miR-27a模拟物转染的细胞中测量的通透性。所显示的结果是归一化的五个 独立HUVEC系的平均值±SEM。*，参照对照P< 0. 05。做在对照LNA(黑色）或miR-27LNA 转染的细胞（白色）中，未经凝血因子刺激（NIL)或凝血因子刺激之后（T)所测量的通透 性。结果是来自代表所进行的3次实验的平均值的一次实验+SEM，*p< 0. 05。巧）用皮 内注射到小鼠背部中的4yg对照（黑色）或抗miR-27a(白色柱）进行迈尔斯分析。24小 时后，将VEGF或PBS(NIL)作为对照给予到相同位点。*p< 0. 01**p< 0. 001，n= 9小鼠 /组。
[0048] 图3.miRNA-27a的过表达降低体内毛细管形成而miR-27a抑制体内通透性降低。
[004引 （A)用对照（i和iU)或miR-27a模拟物（ii和iv)转染HUVEC并且涂铺至基 质胶上。收回的管子：白色箭头。非常细的管子；黑色箭头。a)和扣）比例尺；200ym。 (iii)、（iv)比例尺；400ym。（V)每个视野形成的毛细管的数目，W相对于对照的百分比 表示。*参照对照P< 0. 05。四个独立HUVEC系的平均值+SEM。炬）将小鼠皮下植入含 有FGF-2和仅媒介物（i，V)、对照（ii，Vi)或miRNA-27a模拟物（iii，vii)的基质胶塞。 代表性组织切片和苏木精和伊红染色的截面（i-iii)，比例尺；20ym。定量的含有红细胞 的血管的数目（iv)。代表性CD31免疫化学，（v-vii)。比例尺；50ym。定量的CD31阳性