的是水肿的抑制和血 管生成反应的增加。
[019引虽然上文所描述的布洛克妙被设计成祀向VE-巧粘蛋白中的miR-27a结合位点， 但该一位点在其它预期祀标中是高度同源的。因此，本发明人研究了VE-巧粘蛋白定向布 洛克妙针对两种其它miR-27a经验证祀标沈MA6A和PPAR丫的特异性（Lin等，2009 ;化OU 等，2011)。虽然抗mR-27aLNA诱导VE-巧粘蛋白和SEMA6A蛋白质表达的增加，与该些一致 的是祀mRNA，但是仅CD5-2诱导VE-巧粘蛋白的显著增加（图7A和7B)。类似地，LNA还 显著调节PPAR丫蛋白表达，而CD5-2不调节（数据未显示）。本发明人还使用巧光素酶报 告子分析来研究使用含有VE-巧粘蛋白的整个（1548bp区）3'UTR的质粒对VE-巧粘蛋白 的调节。在化La细胞中，miR-27a过表达引起VE-巧粘蛋白巧光素酶活性的预期抑制。布 洛克妙CD5-2逆转miR-27a介导的抑制，而被设计针对PPAR丫中的miR-27a结合位点的布 洛克妙不逆转（图7C)。LNA逆转由miR-27a过表达引起的抑制。VE-巧粘蛋白中miR-27 位点的突变消除了由CD5-2造成的抑制。该些使用蛋白质表达与翻译报告子分析的实验证 实了布洛克妙的设计中的选择性的程度，其中布洛克妙CD5-2显示针对VE-巧粘蛋白而不 针对SEMA6A和PPAR丫的活性。此外，表明虽然布洛克妙结合于VE-巧粘蛋白的3'UTR中 的miR-27a结合位点，其不激活miRNA降解机制，估计可能因为缺乏对必需的辅助蛋白的募 集。
[0199] 实施例6-针对VE-巧粘蛋白的布洛克妙抑制肿瘤生长
[0200] 鉴于W上所描述的布洛克妙对VE-巧粘蛋白的影响，本发明人研究了施用该些布 洛克妙对体内肿瘤生长的影响。将含于200ylPBS中的同基因的B16F10细胞（4X105)皮 下注射至巧7BL/6雌性小鼠巧周龄）的背部右侧区域中。当肿瘤可见时（注射B16F10细 胞之后第6天），将布洛克妙CD5-2或错义对照静脉注射至小鼠（每组=个小鼠）中。每 天用卡尺使用下式测量肿瘤体积；V= X [cfXDVe，其中d是肿瘤短轴而D是肿瘤长轴。 如图8中所示，在施用布洛克妙CD5-2的小鼠中，肿瘤体积与那些施用错义对照布洛克妙的 小鼠中相比W基本上更慢的速率增大。
[0201] 参考文献
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【主权项】
1. 一种寡核苷酸，其包含与包含SEQ ID NO :1或包含1、2或3个取代的SEQ ID NO :1 的RNA序列的至少8个连续碱基互补的连续序列，其中所述寡核苷酸抑制miR-27a、其变体 或包含含序列UCACAG的种子区的miRNA结合于所述RNA。2. 如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与包含SEQ ID NO :2或包含 1、2或3个取代的SEQ ID NO :2的RNA序列的至少8个连续碱基互补的连续序列，其中所 述寡核苷酸抑制miR-27a、其变体或包含含序列UCACAG的种子区的miRNA结合于所述RNA。3. 如权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述miR-27a miRNA是包含SEQ ID NO :11 中所示的核苷酸序列的hsa-miR-27a。4. 如权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO :2或包含1、2或 3个取代的SEQ ID NO :2的至少或约7个碱基、至少或约8个碱基、至少或约9个碱基、至 少或约10个碱基、至少或约11个碱基、至少或约12个碱基、至少或约13个碱基、至少或约 14个碱基、至少或约15个碱基、至少或约16个碱基、至少或约17个碱基、至少或约18个碱 基、至少或约19个碱基、至少或约20个碱基、至少或约22个碱基、至少或约25个碱基、至 少或约30个碱基或至少或约35个碱基的序列互补的连续序列。5. 如权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸结合于SEQ ID NO : 2的位置22-27。6. 如权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与SEQ ID NO :2 之间的碱基配对包括 SEQ ID N0:2 的位置 8-28、8-27、9-27、10-27、11-27、12-27、13-27、 14-27、15-27、16-27、17-27、18-27、19-27、20-27、21-27、9-28、10-28、11-28、12-28、13-28、 14-28、15-28、16-28、17-28、18-28、19-28、20-28 或 21-28。7. 如权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO :3 或SEQ ID NO :4中所示的序列。8. 如权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一个或多个修 饰型核喊基。9. 如权利要求8所述的寡核苷酸，其中所述修饰型核碱基是LNA核碱基、UNA核碱基或 2 ^ 0-甲基核碱基。10. 如权利要求1至9中任一项所述的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 或SEQ ID NO :7中所示的序列。11. 一种组合物，其包含如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸。12. 如权利要求11所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的载 体、赋形剂或稀释剂。13. -种用于调节细胞中VE-钙粘蛋白的活性的方法，所述方法包括使所述细胞与有 效量的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求11或12所述的组合物 接触，从而调节所述VE-钙粘蛋白的活性。14. 根据权利要求13所述的方法，其中调节VE-钙粘蛋白的活性抑制或降低血管通透 性，治疗或预防血管通透性相关疾病或病状，抑制肿瘤生长，治疗缺血性损伤，增强从缺血 性损伤恢复，治疗手术创伤和/或促进手术后恢复，或促进或诱导血管生成。15. -种用于抑制或降低血管壁血管的血管通透性的方法，所述方法包括使所述血管 与有效量的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求11或12所述的组 合物接触。16. -种用于抑制或降低需要所述治疗的受试者的血管通透性的方法，所述方法包括 向所述受试者施用有效量的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求11 或12所述的组合物。17. -种用于治疗或预防受试者的血管通透性相关疾病或病状的方法，所述方法包括 向所述受试者施用有效量的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求11 或12所述的组合物。18. 如权利要求17所述的方法，其中所述血管通透性相关疾病或病状选自水肿、心血 管疾病、心肌梗塞、周围性血管疾病、局部缺血、中风、癌症、动脉粥样硬化、银肩病、糖尿病、 诸如类风湿性关节炎等自体免疫疾病、血小板减少、高空病、气压损伤、医原性病症、细菌感 染、病毒感染以及与血管渗漏相关的眼部病状，诸如非增生性和增生性视网膜病变、黄斑水 月中、青光眼以及黄斑变性。19. 一种用于治疗或预防受试者的水肿的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效 量的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求11或12所述的组合物。20. 如权利要求18或19所述的方法，其中所述水肿选自心脏水肿、肺水肿、肾水肿、黄 斑水肿、脑水肿、营养不良性水肿、淋巴水肿或由手术程序引起的水肿。21. -种用于抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量 的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求11或12所述的组合物。22. -种用于治疗缺血性损伤和/或增强从缺血性损伤恢复的方法，所述方法包括向 需要所述治疗的受试者施用有效量的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权 利要求11或12所述的组合物。23. -种用于促进或诱导受试者的细胞或组织中的血管生成的方法，所述方法包括向 所述受试者或向由其衍生的细胞或组织施用有效量的如权利要求1至10中任一项所述的 寡核苷酸或如权利要求11或12所述的组合物。24. 如权利要求19所述的方法，其中所述对血管生成的促进或诱导是用于创伤愈合、 组织修复、组织再生或组织工程改造。25. 如权利要求23或24所述的方法，其中所述创伤是手术创伤并且所述血管生成是手 术后血管生成。26. -种用于治疗手术创伤和用于促进手术后恢复的方法，所述方法包括向有需要的 受试者施用有效量的如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求11或12 所述的组合物。27. 如权利要求25或26所述的方法，其中所述手术创伤由牙科手术、心脏手术、器官移 植手术、膝关节和髋关节置换手术以及截肢引起。28. -种如权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸用于制造用于调节VE-钙粘蛋白 的活性的药剂的用途。29. 根据权利要求28所述的用途，其中调节VE-钙粘蛋白的活性抑制或降低血管通透 性脉管通透性、治疗或预防血管通透性相关疾病或病状、抑制肿瘤生长、治疗缺血性损伤、 增强从缺血性损伤恢复或促进或诱导血管生成。
【专利摘要】本发明提供抑制miR-27a结合于VE-钙粘蛋白mRNA的寡核苷酸，其尤其呈布洛克妙形式。本发明还提供包含所述寡核苷酸的组合物以及使用所述寡核苷酸调节VE-钙粘蛋白的活性、抑制或降低血管通透性、治疗或预防血管通透性相关疾病或病状、抑制肿瘤生长、治疗缺血性损伤、增强从缺血性损伤恢复、治疗手术创伤和/或促进手术后恢复以及促进或诱导血管生成的方法。
【IPC分类】A61K48/00, A61K31/7088, C12N15/113, A61P9/00, A61P35/00, A61P7/10
【公开号】CN104995300
【申请号】CN201380061417
【发明人】詹尼弗·甘布尔, 马修·瓦达斯, 索尔莱夫·默勒
【申请人】百年癌症药物与细胞生物学研究所, 米瑞克斯治疗公司, 悉尼大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2013年10月2日
【公告号】CA2886745A1, EP2904102A1, WO2014053014A1