利用SNP标记rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴别蜜蜂蜂群王浆高产性状的方法，具体涉及一种利用SNP标记 rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状的方法，属生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 蜂王浆具有许多重要的营养和药物价值，对人类健康十分有益，是天然的滋养食 品。我国是养蜂大国，蜂王浆的产量占世界总量的90%以上，这与我国饲养的蜜蜂品种有着 密不可分的关系。我国的蜂业科学家和科技人员经过蜜蜂集团闭锁繁殖育种方法培育出了 "浙农大1号"和萧山浆蜂，产浆能力显著高于中华蜜蜂和其它蜂种，同时也具有良好的蜂 蜜采集能力，已成为我国的特有和主要饲养蜂种。一直以来，我国的蜂业科技工作者致力于 王浆高产蜜蜂的相关研究，以期发现王浆高产机制和王浆高产性状相关的遗传标记等，加 强王浆高产蜂种的保种和选育工作，充分发挥我国优良蜂种资源的优势。就王浆高产性状 相关研究、分子标记意义和SNP技术及其在蜜蜂研究领域的应用等方面进行的研究概述如 下： 1、王浆高产性状相关标记的研究 (1)形态学遗传标记：蜜蜂咽下腺是位于工蜂头部的合成并分泌蜂王浆的主要腺体，其 活性常被用于衡量蜜蜂的泌浆能力。邵瑞宜等（2003)发现工蜂头重与咽下腺重量存在极 显著相关性，且咽下腺重量可作为衡量王浆生产性能的重要指标，因此吐浆工蜂的头部重 量与王浆生产性能可能存在一定相关性。郑爱娟等（2010)发现，各日龄浆蜂工蜂蛹的头重 均极显著高于原种意大利蜜蜂工蜂蛹头重，工蜂头重有可能成为王浆高产蜂种在外部形态 学水平上的标记。此外，人们研究咽下腺的解剖形态学发现，工蜂的咽下腺小囊数、咽下腺 大小和重量、以及咽下腺体外合成蛋白质的速率均可作为咽下腺活性的衡量指标，其中工 蜂的咽下腺长度与王浆产量的相关性最大，可能作为意蜂王浆生产性能较理想的形态学遗 传标记。
[0003] (2)细胞学遗传标记：通过对"浙农大1号"意蜂雄蜂和原种意蜂雄蜂的染色体 核型进行分析比较发现，两个不同蜂种雄蜂的第7、10、12条染色体的臂比存在着极显著差 异。这种差异可能是"浙农大1号"意蜂雄蜂染色体复制时，控制产浆性状的多对等位基因 片段重复复制，造成了微效基因数增多的缘故。染色体G带分析中还发现第3条染色体"浙 农大1号"意蜂比原种意蜂多了一个条带。
[0004] (3)生化遗传标记：同工酶是生化标记的一种，由于遗传差异可以产生多种酶形 式。在蜜蜂领域研究比较多的是苹果酸脱氢酶（MDH)，该酶由三个等位基因编码：MDH I、 MDH II和MDH III，只有MDH II在蜜蜂的不同级型和发育阶段表现出多态性。关迎辉等 (1994)研究发现，王浆高产蜜蜂("浙农大1号"意蜂）的MDH II杂合度比其他两种意蜂(湖 北意蜂和原种意大利蜜蜂）的高，且新发现了其他两种王浆低产意蜂中所没有的aa、ab基 因型，可作为王浆高产蜂种的生化遗传标记。此外，西方蜜蜂的三个蜜蜂亚种的MDH II的基 因型频率、基因频率及杂合纯合度均存在极显著差异，这一结果表明，可通过测定MDH II的 基因频率和杂合纯合度从生化遗传角度对不同蜂种进行鉴定。鲍秀良（1997)研究报道，王 浆高产蜜蜂("浙农大1号"意蜂）及其他四种意蜂品系的MDH II多态性呈显著性差异。综 上得知，蜜蜂的苹果酸脱氢酶II (MDH II)有可能成为王浆高产性状相关的生化水平的遗传 记 D
[0005] (4)分子遗传标记：基因多态性是指在生物体中普遍存在的两种或两种以上的基 因型或等位基因，在有关王浆高产蜂种遗传标记的研究中也有应用。"浙农大1号"、平湖和 萧山浆蜂均为王浆高产蜂种，分属于3种不同的蜜蜂品系。张娅娟等（2001)通过对这三个 品种的蜜蜂进行随机扩增多态DNA-PCR (RAPD-PCR)分析，得到了共同的特异性DNA片段 W316bp，这一现象说明该DNA片段可能与王浆高产性状相关。接着，蒋滢等（2002)又分别 对这三种浆蜂的工蜂和雄蜂进行了 DNA多态性图谱分析，在三种蜜蜂的工蜂中均有W316bp 的存在，但在雄蜂中没有发现，这表明W316bp仅存在于工蜂中。王尉平等（2002)采用 RAPD-PCR技术同时分析了 3个王浆高产蜂种和王浆低产蜂种卡尼鄂拉蜂的基因多态性，结 果在卡尼鄂拉蜂中没有发现W316bp，而在3种衆蜂中仍有检测到，进一步证明了 W316bp可 作为王浆高产蜂种的遗传标记。随后，戴英等（2003)不仅研究了 3种浆蜂，而且对本地意 蜂、黑环系蜜蜂等也进行了研究，采用特征序列扩增区域（SCARs)法对W316bp进行验证，结 果与前人的研究一致，表明了 W316bp很可能是王浆高产性状相关的一个分子标志。之后金 水华（2003, 2004)也通过实验证明了 W316bp的可靠性。
[0006] 微卫星DNA是普遍存在于生物体基因组中简单的核苷酸重复序列，微卫星标记是 一种广泛应用于动植物育种中的遗传标记。"浙农大1号"、原种意大利蜜蜂和本地意大利 蜜蜂是我国饲养比较多的西方蜜蜂品种，具有不同的产浆能力，李建科等（2003)分析了这 3种蜜蜂的10个微卫星位点，发现这些微卫星位点在每种蜜蜂中扩增出来的等位基因数均 不同，呈现出为多态性，其中"浙农大1号"蜜蜂的特有等位基因最多，并根据等位基因频率 的分析结果找到了 7个可以作为王浆高产蜂种的微卫星标记，并通过遗传距离分析印证了 "浙农大1号"蜜蜂的进化史。
[0007] 潘娇等（2012)采用覆盖了蜜蜂基因组的基因芯片技术对王浆高产蜂种和低产蜂 种进行了分析，筛选出369个差异表达基因，其中上调表达基因201个，下调表达基因168 个，通过生物信息学的分析，发现这些基因可能参与了蜜蜂与分泌蜂王浆相关的生物学过 程，如嗅觉系统、神经系统、运动系统以及腺体功能发育等。进一步的qPCR检测和相关性分 析表明有3个基因（dop2、S SRbeta和hex71)与王浆高产性状密切相关，认为其可作为王浆 高产的分子标记。
[0008] 以上这些关于蜜蜂王浆高产性状相关的研究大多数在蜜蜂基因组测序完成之前 进行的，采用的方法比较传统，筛选的范围存在一定的局限性，因而有学者提出质疑。比较 可靠的是潘娇等（2012)采用基因芯片技术在蜜蜂基因组范围内筛选出来的3个分子标记， 但是采用该方法检测需提取蜜蜂RNA并使用荧光定量仪器，使鉴定过程复杂、成本较高，不 利于该方法的普及。
[0009] 因此，采用强大成熟、更加科学的分子研究技术从基因水平对王浆高产性状进行 研究，从而寻找一种操作简单、可靠性高、成本低的方法来鉴别蜜蜂的蜂王浆生产性能显得 尤为重要。
[0010] 2、SNP 技术 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)被称为第3代DNA分子标 记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，常见的是单个核苷酸的替换，且 常发生在嘌呤碱基（A与G)和嘧啶碱基（C与T)之间。SNP标记可帮助区分两个个体遗 传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记之一。目前，可以通过提取基因组DNA并 随机打断、加上接头、上机测序、生物信息学分析等步骤可以准确获得基因组的SNP信息， 筛选出与特异性状相关的SNP分子标记。
[0011] 作为新一代生物技术，虽然SNP技术具有极高的实用价值、在人类疾病领域的应 用已取得了一定进展。本发明采用SNP技术对意大利蜜蜂成年工蜂王浆高产性状进行鉴 定，据此可以准确、高效、快速地选择王浆高产蜜蜂进行育种，为通过基因手段培育更加优 质的产浆蜂种奠定良好基础。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是提供一种利用SNP标记rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状的方 法。
[0013] 本发明的目的通过以下技术方案实现。
[0014] 本发明的利用SNP标记rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状的方法，其特征在于鉴 别步骤如下： (1) 蜜蜂个体取样：从考察的意大利蜜蜂蜂群中，收集成年蜜蜂工蜂个体，随机取样，每 群以50只蜜蜂代表整个蜂群，将蜜蜂样本放于-20°C冰箱中冷冻备用； (2) 蜜蜂样本DNA的提取：分别取步骤（1)蜜蜂冷冻样本的头部和胸部，进行组织破碎， 提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度测定； (3) 合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下： Primer-F :5' - GTCCTTTTGATTTATATGACTGT -3' Primer-R :5' - TGGCCAATCGATAACTATGT -3' (4) PCR检测：以步骤（2)蜜蜂基因组DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进 行 PCR ; 反应的体系为：总体积30 μ L，内含反应底物Mix 15 μ L，Primer-F 1 μ L，Primer-R 1 μ L，DNA 模版 2 μ L，ddH20 11 μ L ; 反应的条件为：94 °C预变性5min;94°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸I min， 共35个循环；72 °C延伸8 min ; 对PCR反应产物进行凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序； (5) 鉴别蜂群王浆高产性状：将步骤（4)的测序结果用Alignment软件进行序列比对分 析，根据蜂群的C等位基因频率直，鉴别蜂群王浆高产性状。当蜂群的T等位基因频率 显著大于C等位基因频率时，则此蜂群为王浆高产蜂群。所述显著指统计学的P〈0. 05。所 述SNP标记为蜜蜂王浆高产相关的基因组位点rsl6287910。
[0015] 本发明采用SNP位点rs5749071来鉴定王浆高产蜜蜂的方