法是经过严格的筛选和 验证的。以王浆高产蜂种("浙农大1号")和王浆低产蜂种(美国意大利蜜蜂）为研究对象， 提取蜜蜂样本的基因组DNA，然后送于北京百迈克生物技术公司采用SLAF-seq技术进行 单体型测序和分子标记的开发，进一步进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS)，初步筛选出21个与王浆高产性状相关的SNPs。另外，采集王浆高、低产蜜蜂 样本，通过PCR和DNA测序技术对初步筛选的SNPs进行验证，最终筛选出rs5749071，作为 蜂王浆产量性状相关的分子标记。
[0016] 本发明的优点及有益效果： 1、蜂群的产浆能力会受到基因型的影响，而且存在王浆高产蜂群中特定等位基因显著 高于王浆产量低的蜂群。该SNP标记等位基因 T基因频率尸;在王浆高产蜂群和王浆低产 蜂群中的差异极显著，即王浆高产蜂群中T等位基因频率显著高于王浆低产蜂群中T等位 基因频率，因此根据此结果可以方便、快捷、准确地鉴定蜂群是否具有王浆高产的能力。
[0017] 2、根据统计指标判断蜂群的蜂王浆生产能力：蜂群中随机采集的蜜蜂工蜂个体在 该SNP位点冬> ^ (P〈 0.05)的是王浆高产蜂群，冬〈^ (P〈 0.05)的是王浆低产蜂群。 据此选择王浆产量高的蜂群，提高蜂群的王浆产量，从而增加蜂农的收入。采用本发明利用 蜜蜂王浆高产相关的SNP标记鉴别蜂群王浆高产性状的方法，可以大大提高效率。
[0018] 3、使用本发明方法目前主要在实验室从分子水平掌握蜜蜂的王浆高产机制，检测 与产浆性状相关的分子遗传标记，并结合分子遗传标记辅助蜜蜂品种选育技术，不但能保 证选择的准确性，还可以加快蜜蜂品种选育速度，大大提高了选育王浆高产蜂种的成功率， 可以安全、有效、快速地进行王浆高产蜂种的鉴别。
【附图说明】
[0019] 附图为蜜蜂王浆高产相关的SNP标记rs5749071的基因型判断参考峰图。其中： 图1中方框标注的SNP标记基因型为纯合CC，主要存在于蜂王浆低产蜂群中； 图2中方框标注的SNP标记基因型为纯合TT，主要存在于蜂王浆高产蜂群中。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。
[0021] 实施例1 一种利用SNP标记rs5749071鉴别蜜蜂蜂群王浆高产性状的方法，包括以下步骤： (1) 蜜蜂取样：王浆高产蜂种("浙农大1号"）和王浆低产蜂种(美国意大利蜜蜂）各取 50只成年蜜蜂工蜂个体，将每个个体分别放在一个离心管中，于_20°C冷冻保存备用； (2) 蜜蜂样本DNA的提取(使用生工公司的动物基因组快速提取试剂盒，SK8222) ①将步骤（1)的工蜂个体用眼科手术剪剪去四肢、翅膀和腹部，仅保留头部和胸部，放 于盛有液氮的研钵中，用研磨棒破碎，然后转移到1.5 mL离心管中，加入400 μ L Buffer Digestion，震荡均匀，65 °C水浴I h至细胞完全裂解。然后取出上清液加入10 μ L的RNA 酶 A (IOmg ^mL-I )，静置 5 min。
[0022] 讓加入200 μ L Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20Γ冰箱放置5 min。
[0023] 譲室温10000 rpm离心5 min，将上清液400 μ L转移到新的I. 5 mL离心管中， 加入等体积的氯仿混勾，12000 rpm离心取上清。
[0024] 賺加入400 μ L异丙醇，手工震荡I min，室温放置2 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清液。
[0025] 藝加入I mL体积比为75%的乙醇(超纯水稀释)，轻微震荡I min，使沉淀悬浮起 来，室温10000 rpm离心2 min，弃上清液。
[0026] 議重复步骤;1) 一次。
[0027] 顏打开离心管盖倒置在干净纸巾上，至残留的乙醇完全挥发，获得DNA。
[0028] _将得到的DNA用50 μ L TE Buffer溶解，用琼脂糖凝胶和NanoDrop 2000紫外 分光光度计检测提取的DNA质量，最后将其放于-20°C保存备用。
[0029] (3)合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下 Primer-F :5' - GTCCTTTTGATTTATATGACTGT -3' Primer-R :5' - TGGCCAATCGATAACTATGT -3' 将上、下游引物分别稀释至10 ymol/yL，用后-20°C保存。
[0030] (4)PCR检测：以步骤（2)的每个蜜蜂个体的DNA为模版，以Primer-F和Primer-R 为引物进行PCR，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液 进行测序。
[0031] PCR 反应体系（30 μ L):
查看PCR产物测序峰图，定位该SNP标记在峰图中的位置，基因型峰图标准如图1、图 2、标记位置显示，判断每个样本该标记是纯合CC或纯合TT两种类型中的哪种基因型并统 计。
[0033] (6)利用SNP标记rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状：将步骤（4)的PCR测序结 果用Alignment软件进行序列比对、统计该标记峰图类型，计算出基因型和基因频率，如表 1所示。根据分析结果，如果鉴定蜂群的T等位基因频率显著大于C等位基因频率，可判断 蜂群为蜂王产浆高产蜂群。
[0034] 表1不同基因型对蜂群产浆能力的影响及基因频率分布情况
表1通过费希尔确切概率T检验（Fisher's Exact Test)统计得到/M.61E-14 <t). 05,表明不同产浆能力的蜂群与不同基因型之间存在极显著差异，具有统计学意义，表 明蜂群的产浆能力会受到基因型的影响。王浆低产组的冬极显著小于而高产组中尸# 于尺。
[0035] 本发明采用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯）： 无水乙醇，异丙醇，氯仿，超纯水，全式金Trans DNA Marker I，全式金2XEasyTaq PCR SuperMix，全式金琼脂糖，全式金Galstain，生工50 X TAE电泳缓冲液，动物基因组快速提 取试剂盒SK8222,上下游引物由合成，核酸酶A。
[0036] 本发明所使用的仪器主要如下： Axygen L 5 mL离心管，Axygen PCR管，微波炉，电子天平，震荡器，小型离心机，水浴 锅，微量移液枪，电泳仪，ABI公司96孔PCR仪，上海培清科技有限公司凝胶成像分析仪，高 速离心机，低温冰箱，高压灭菌锅，NanoDrop 2000等。
【主权项】
1. 一种利用SNP标记rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状的方法，其特征在于鉴别步骤 如下： (1) 蜜蜂个体取样：从考察的意大利蜜蜂蜂群中，随机收集成年蜜蜂工蜂个体，每群以 50只蜜蜂代表整个蜂群，将蜜蜂样本放于-20°C冰箱中冷冻备用； (2) 蜜蜂样本DNA的提取：分别将步骤（1)中冷冻蜜蜂样本的头部和胸部，进行组织破 碎，提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度测定； (3) 合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下：： Primer-F :5' - GTCCTTTTGATTTATATGACTGT -3' Primer-R :5' - TGGCCAATCGATAACTATGT -3' ； (4) PCR检测：以步骤（2)蜜蜂DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR ; 反应的体系为：总体积30 y L，内含反应混合物Mix 15 y L，Primer-F I y L，Primer-R I y L，DNA 模版 2 y L，CldH2O 11 y L ; 反应的条件为：94 °C预变性5min;94°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸I min， 共35个循环；72 °C延伸8 min ; 对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序； (5) 鉴别蜂群王浆高产性状：将步骤（4)的测序结果用Alignment软件进行序列比对分 析，根据蜂群的T等位基因频率直，鉴别蜂群王浆高产性状。2. 根据权利要求1所述的一种利用SNP标记rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状的方 法，其特征在于当蜂群的T等位基因频率显著大于C等位基因频率时，此蜂群为王浆高产蜂 群，所述显著指统计学的P〈〇. 05。
【专利摘要】本发明涉及一种利用SNP标记rs5749071鉴别蜂群王浆高产性状的方法，包括蜜蜂个体取样、蜜蜂样本DNA提取、引物合成、PCR检测和鉴别蜂群王浆高产性状，根据从该蜂群中随机收集的工蜂个体在该SNP标记rs5749071出现C等位基因的频率<i>P</i><i>C</i>和T等位基因的频率<i>PT</i>之间是否存在显著差异，鉴别蜂群王浆高产性状。本发明从分子生物学水平，提供了使用意大利蜜蜂工蜂个体王浆高产相关的SNP（rs5749071）标记科学、准确、快速地鉴别意大利蜜蜂蜂群王浆高产性能，可以大大缩短王浆高产意大利蜜蜂品种的选育周期，加快蜜蜂育种速度。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105018624
【申请号】CN201510479033
【发明人】苏松坤, 刘小彦, 李志国, 刘元珍, 许叔鹏
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月3日