dcf1敲除小鼠模型的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种dcfl敲除小鼠模型的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002]嗅觉同视觉、听觉一样，是人体原始的感觉功能之一，嗅觉可以通过中枢神经系统影响人的情绪，嗅觉障碍患者对周围事物兴趣下降，反应平淡，严重的甚至造成精神上的抑郁。因此对于嗅觉的基础研究具有非常重要的现实意义。
[0003]小鼠模型是生物学研究中最常用的的研究工具之一，广泛应用于各种疾病模型的构建和研究。在小鼠中关于嗅觉功能的研究也已经有较长的历史，一般通过构建嗅觉障碍小鼠模型来进行研究。
[0004]现有的嗅觉障碍小鼠模型基本都是通过人为破坏嗅神经或者化学物质杀死嗅黏膜细胞的方式进行构建，每一次的实验，都需要重新制造嗅觉障碍小鼠模型，而且外伤性的造模容易对小鼠造成伤害，且损伤程度不易控制。
[0005]树突细胞因子I (dentritic cell factor 1，dcfl),又名跨膜蛋白 59(transmembrane protein 59)，在免疫系统的树突细胞中首次被发现，是一种单次跨膜蛋白。研究发现，dcfl在神经系统中有非常重要的功能，dcfl在C17.2神经干细胞中的过表达可维持细胞的未分化状态，而通过microRNA-351下调dcfl的表达，C17.2神经干细胞向胶质方向分化。实验室前期已经构建成功dcfl全身敲除的小鼠(B57CL/6品系)。dcfl敲除小鼠出现明显的嗅觉障碍。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于克服现有技术中存在的问题，提供一种dcfl敲除小鼠模型的构建方法。
[0007]本发明的目的之二在于提供该小鼠模型的应用。
[0008]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种dcfl敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤为:
a.以pLNT质粒为母质粒，在两个BamH I酶切位点之间插入dcfl基因第一外显子Exonl的DNA片段，并在两BamH I与BamH I的外侧分别装上一个同向排列的1xP位点；然后在该1xP位点和Cla I位点之间插入正筛选标记基因neo ;在所述母质粒的Cla I和Kpn I酶切位点之间插入下游同源重组臂F3片段；在所述Kpn I酶切位点外侧插入负筛选标记基因PGK-TK ;在所述母质粒的Sal I和Not I酶切位点之间插入上游同源重组臂Fl片段，得到Not I线性化的pLNT-dcfl载体；
所述的上游同源重组臂Fl片段是通过扩增下列引物得到:
引物 1:5’ GCCCGCCTCTGCCTCCCGAG 3’
引物 2:5’ GGAGCCCCCAGCAATGGATA 3’；
所述的第一外显子Exonl的DNA片段是通过扩增下列引物得到:引物 3:5 ’ GCCTACCTTCAGGTGCTTGA 3 ’
引物 4:5’ GCAATTTCCGCAGGAGCAAG 3’；
所述的下游同源重组臂F3片段是通过扩增下列引物得到:
引物 5:5 ’ CGGAAGTTTGTGCTGCAGGT 3 ’
引物 6:5 ’ AATATTGGGAC’ TGCTCACTG 3 ’ ；
b.步骤a所得NotI线性化的pLNT-dcf I载体电转入小鼠胚胎干细胞(ES，129/Ola);挑选经G418和Ganeielivor筛选的阳性克隆，即得到含打靶成功基因的小鼠胚胎干细胞；
c.在囊胚腔注射的前2—3天，复苏步骤b所得含打靶成功基因的小鼠胚胎干细胞；在消化细胞前4小时，换细胞培养液，将消化好的细胞悬浮于无LIF的细胞培养液中，置4"C冰箱以备用；
d.6-7周龄C57BL/6J( —种小鼠品系)雌鼠在暗周期前12小时腹腔注射孕马血清，每只10 U ;48小时后再腹腔注射人绒毛膜促性腺激素，每只10 U;注射完毕，每只雌鼠与一只正常性成熟的雄鼠合笼过夜，第二天检查有阴栓的小鼠为囊胚供体，再过3天后，从子宫中取囊胚；
e.选取步骤d所得囊胚中发育正常的囊胚，将15— 20个步骤c所得含打靶成功基因的小鼠胚胎干细胞注入囊胚腔内；
f.将步骤e所得囊胚植入2.5天的假孕母鼠的子宫，得到皮毛嵌合度大于50%的雄性嵌合体小鼠，与C57BL/6J纯系雌性小鼠交配，子代中灰色小鼠来源于生殖系嵌合的ES细胞，其中经鉴定为dcfl基因剔除杂合子的小鼠，记为FO代，与C57BL/6J纯系小鼠交配育种，得到dcfl杂合子小鼠，记为Fl代；再将该Fl代小鼠与EIIa-Cre小鼠交配得到dcfl杂合子小鼠，得到F2代；将该dcfl杂合子小鼠F2代雌鼠与公鼠之间交配，获得dcfl敲除纯合子小鼠，即得到dcfl敲除小鼠模型。
[0009]一种dcfl敲除小鼠模型在嗅觉功能研究中的应用。
[0010]本发明的积极进步效果在于:使用dcfl敲除小鼠模型，可以实现嗅觉障碍性状的稳定遗传，无需每次实验都进行造模过程，省时省力。它在嗅觉行为学评估中表现优异，可作为一种嗅觉障碍小鼠模型成功应用于嗅觉研究中。
【附图说明】
[0011]图1为dcfl敲除小鼠构建示意图
图2为dcfl敲除小鼠对食物埋藏小球嗅觉灵敏度下降。
[0012]图3为dcfl敲除小鼠对不同气味的偏好性发生改变。
[0013]图4为dcfl敲除小鼠的嗅觉判断能力发生改变。
【具体实施方式】
[0014]实施例一
dcfl敲除小鼠构建方法，参见图1。
[0015]1、小鼠dcfl基因位于第4号染色体，小鼠dcfl基因从小鼠的BAC文库(ID:RP23-423N6))克隆得到。打靶载体pLNT- dcfl的构建是以pLNT质粒为母质粒改建而成，如图1所示，在中间插入三个基因，其中BamH I与BamH I之间插入dcfl基因第一外显子(Exonl)的DNA片段，并在两侧装上两个同向排列的1xP位点，neo基因是正筛选标记基因，PGK-TK基因是负筛选标记基因，两侧同样都有1xP位点。上游同源重组臂(Fl)长度为1.2kb (Not 1-Sal I)，下游同源重组臂(F3)长度为4.8kb (Cla I—Kpn I)，中间条件剔除部分(F2)长度为1.4kb，是dcfl基因第一外显子的一部分，下游臂连接PGK-TK。
[0016]2、将Not I线性化的pLNT-dcfl载体电转入小鼠胚胎干细胞(ES，129/Ola)。挑选经G418和Ganeielivor筛选的阳性克隆，即打靶成功后的基因。
[0017]3、ES细胞的准备:在囊胚腔注射的前2— 3天，复苏ES细胞。在消化细胞前4小时，换ES细胞培养液，将消化好的细胞悬浮于无LIF的ES细胞培养液中，置4"C冰箱以备用。
[0018]4、超排和取供体囊胚:6-7周龄C57BL/6J雌鼠在暗周期前12小时腹腔注射孕马血清(10 U/只)，48小时后再腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(10 U/只)。注射完毕，每只雌鼠与一只正常性成熟(8周龄)的雄鼠合笼过夜，第二天检查有阴栓的小鼠为囊胚供体(怀孕0.5天)，再过3天(即胚胎发育3.5天)后，从子宫中取囊胚。
[0019]5、ES细胞显微注射:用毛细管制备持卵管和注射针，在显微注射仪上，选取发育正常的囊胚，以持卵管负压吸附固定，用注射针吸取ES细胞，通过手动或电动显微注射法将15— 20个细胞注入囊胚腔内。
[0020]6、囊胚移植:将2.5天的假孕母鼠麻醉，70%乙醇消毒，在背侧部剪一开口，解剖显微镜
下暴露输卵管和子宫，在靠输卵管的子宫角上用注射针头刺一小孔，将移卵管由此孔中插入，将囊胚吹入子宫。缝合切口，待小鼠苏醒后，放回笼中。约17天后可产仔鼠。
[0021]7、得到皮毛嵌合度大于50%的雄性嵌合体小鼠，与C57BL/6J纯系雌性小鼠交配，子代中灰色小鼠来源于生殖系嵌合的ES细胞，其中经鉴定为dcfl基因剔除杂合子的小鼠，记为FO