代，与C57BL/6J纯系小鼠交配育种。得到dcfl杂合子小鼠(Fl代)。
[0022]8、dcfl杂合子小鼠(Fl代)与EIIa-Cre小鼠交配得到dcfl杂合子小鼠(F2代)，dcfl杂合子小鼠(F2代)雌鼠与公鼠之间交配，获得dcfl敲除纯合子小鼠。
[0023]实施例二:食物埋藏小球实验检测dcfl敲除小鼠的嗅觉灵敏度
实验前一天，禁止小鼠进食，正常供应饮用水。不提供鼠粮，使老鼠处于极度饥饿状态。每只笼子铺满3cm厚的玉米芯垫料，每只笼子中随机埋入一粒0.5g大小的鼠粮，深度大约为0.5cm。实验人员I将小鼠放入测试笼子中，盖上笼盖(防止老鼠爬出笼子)，实验人员2同时开始计时，待小鼠找到鼠粮并挖出，用前肢抓住，实验结束，停止计时，记录时间，若小鼠5分钟内未找到，也结束实验。对照组野生型小鼠和dcfl敲除小鼠各10只。每只老鼠对应一个笼子，保证不串气味。总共进行了五次实验，每次间隔10分钟，两组小鼠各十只。
[0024]由于小鼠饿了一天，对于食物的渴望程度很高，同时食物小球埋于垫料中，小鼠看不见小球，只能通过气味线索来判断小球位置并挖出，因此可以测试小鼠的嗅觉功能。结果如图2所示。5次实验中，dcfl敲除小鼠找到食物小球的平均用时均比野生型小鼠多，并且都有显著性差异(P < 0.01)。说明dcfl敲除以后，小鼠的嗅觉受到影响，灵敏度有所下降。5次实验中，第一次用时是最长的，随着实验次数的增加，找到食物小球的时间也越短，从第三次开始，时间趋于稳定，野生型小鼠稳定在22秒上下，dcfl敲除小鼠稳定在62秒上下，这是因为第一次实验是在小鼠饿了一天之后进行，小鼠对于鼠笼的情况是完全未知的，找到食物小球用时相对较长，当进行第二次实验，小鼠对于实验环境有所熟悉，用时相对第一次短一些，到第三次开始，时间趋于稳定，但两者之间的显著性差异是始终存在的。
[0025]实施例三
嗅觉偏好实验检测dcfl敲除小鼠的嗅觉偏好性
实验小鼠在每个笼子单独放置I个小时，以适应环境。摄像头从侧面对准笼子一侧，放入一张3cmX3cm的滤纸于笼子中，滤纸上浸润指定的溶液。实验时间3分钟，结束实验，拿出滤纸，老鼠放回原笼子。对照组野生型小鼠和dcfl敲除小鼠各10只。用秒表统计小鼠嗅探滤纸的总时间，若小鼠用舌头舔滤纸或者用前肢抓滤纸，这些时间都不能计入。
[0026]小鼠能够分辨不同的气味，这些气味大致可以分为三类，喜好气味、中性气味(既不喜欢，也不厌恶)和厌恶气味三种。在嗅觉偏好实验中，我们分别用水(对照)、母鼠的尿液(喜好气味)、丁子香酚(中性气味)、丙酮(厌恶气味)来进行实验。结果如图3所示。两种小鼠对于水的探究时间均在5秒左右，对于丁子香酚的探究均在6秒左右，均无差异。dcfl敲除小鼠探究母鼠尿液的时间为20秒左右，远远低于野生型小鼠的35秒，且有显著性差异(P<0.01)，而dcfl敲除小鼠探究丙酮的时间为10秒左右，高于野生型小鼠的5秒，同样有显著性差异(P < 0.0D0
[0027]实施例四
气味躲避实验检测dcfl敲除小鼠的嗅觉判断能力
实验前，使用挡板将鼠笼隔为两部分，比例为1:3，在较小空间(空间B)—侧，放置一张3cmX 3cm的滤纸，滤纸用ΙΟΟμΙ超纯水浸润，将实验小鼠放入较大空间一侧(空间Α)，Noldus软件开始跟踪小鼠活动轨迹，时间3分钟。移除滤纸，重新放入一张3cm X 3cm的滤纸，滤纸用ΙΟΟμΙ丙酮浸润，同样记录小鼠轨迹3分钟。对照组野生型小鼠和dcfl敲除小鼠各10只。统计小鼠在滤纸浸水情况下在空间A停留的时间，记为Tl，以及滤纸浸丙酮的情况下，在空间A停留的时间，记为T2，然后将计算每只小鼠的T=T1-T2。
[0028]小鼠对于厌恶气味会有本能的躲避反应，实验组，空间A视为躲避区，可以通过小鼠在空间A停留的时间长短评估小鼠的嗅觉判断分辨能力。结果如图4所示。dcfl敲除小鼠在空间A停留的时间明显比野生型小鼠多，且有显著性差异。
[0029]应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.一种dcfl敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.以pLNT质粒为母质粒，在两个BamHI酶切位点之间插入dcfl基因第一外显子Exonl的DNA片段，并在两BamH I与BamH I的外侧分别装上一个同向排列的1xP位点；然后在该1xP位点和Cla I位点之间插入正筛选标记基因neo ;在所述母质粒的Cla I和Kpn I酶切位点之间插入下游同源重组臂F3片段；在所述Kpn I酶切位点外侧插入负筛选标记基因PGK-TK ;在所述母质粒的Sal I和Not I酶切位点之间插入上游同源重组臂Fl片段，得到Not I线性化的pLNT-dcfl载体； 所述的上游同源重组臂Fl片段是通过扩增下列引物得到: 引物 1:5’ GCCCGCCTCTGCCTCCCGAG 3’ 引物 2:5’ GGAGCCCCCAGCAATGGATA 3’； 所述的第一外显子Exonl的DNA片段是通过扩增下列引物得到:引物 3:5 ’ GCCTACCTTCAGGTGCTTGA 3 ’ 引物 4:5’ GCAATTTCCGCAGGAGCAAG 3’； 所述的下游同源重组臂F3片段是通过扩增下列引物得到:引物 5:5 ’ CGGAAGTTTGTGCTGCAGGT 3 ’引物 6:5 ’ AATATTGGGAC’ TGCTCACTG 3 ’ ； b.步骤a所得NotI线性化的pLNT-dcf I载体电转入小鼠胚胎干细胞(ES，129/Ola);挑选经G418和Ganeielivor筛选的阳性克隆，即得到含打靶成功基因的小鼠胚胎干细胞； c.在囊胚腔注射的前2—3天，复苏步骤b所得含打靶成功基因的小鼠胚胎干细胞；在消化细胞前4小时，换细胞培养液，将消化好的细胞悬浮于无LIF的细胞培养液中，置4"C冰箱以备用； d.6-7周龄C57BL/6J( —种小鼠品系)雌鼠在暗周期前12小时腹腔注射孕马血清，每只10 U ;48小时后再腹腔注射人绒毛膜促性腺激素，每只10 U;注射完毕，每只雌鼠与一只正常性成熟的雄鼠合笼过夜，第二天检查有阴栓的小鼠为囊胚供体，再过3天后，从子宫中取囊胚； e.选取步骤d所得囊胚中发育正常的囊胚，将15— 20个步骤c所得含打靶成功基因的小鼠胚胎干细胞注入囊胚腔内； f.将步骤e所得囊胚植入2.5天的假孕母鼠的子宫，得到皮毛嵌合度大于50%的雄性嵌合体小鼠，与C57BL/6J纯系雌性小鼠交配，子代中灰色小鼠来源于生殖系嵌合的ES细胞，其中经鉴定为dcfl基因剔除杂合子的小鼠，记为FO代，与C57BL/6J纯系小鼠交配育种，得到dcfl杂合子小鼠，记为Fl代；再将该Fl代小鼠与EIIa-Cre小鼠交配得到dcfl杂合子小鼠，得到F2代；将该dcfl杂合子小鼠F2代雌鼠与公鼠之间交配，获得dcfl敲除纯合子小鼠，即得到dcfl敲除小鼠模型。2.—种dcfl敲除小鼠模型在嗅觉功能研究中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种dcf1敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本发明涉及这一动物模型的嗅觉研究中的应用，通过食物埋藏小球实验，嗅觉偏好实验，气味躲避实验，检测dcf1敲除小鼠对于嗅觉的灵敏度、判断力和偏好性。结果显示，dcf1敲除小鼠的嗅觉灵敏度和判断能力下降，嗅觉偏好性发生改变。相比较于已有的嗅觉障碍小鼠模型需要人工损伤或者化学损伤造模，不仅费时费力，而且易造成小鼠的其它损伤，使用dcf1敲除小鼠模型省去了这些步骤，而且嗅觉障碍性状稳定，是适合研究嗅觉的小鼠模型。
【IPC分类】A01K67/027, C12N5/10, C12N15/85
【公开号】CN105039400
【申请号】CN201510257151
【发明人】文铁桥, 郭健健, 冯瑞丽, 王娇
【申请人】上海大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月19日