一种抗乙肝病毒表面抗原的全人源抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了抗乙肝表面蛋白抗体的制备 技术及其在预防HBV感染和治疗HBV相关肝细胞肝癌中的用途。
【背景技术】
[0002] 乙肝病毒Ofepatitis B virus，HBV)是双链DNA病毒，人体被感染后易引起慢性 乙型肝炎，进而导致肝硬化和（或）肝癌。据统计近年来全球约有3.5亿HBV感染者，每年 约有100万~150万人死于急性或慢性HBV感染导致的肝功能衰竭，肝硬化和（或）肝癌， 因而预防HBV感染成为世界公共健康问题[ 1]。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC， 简称肝癌）与病毒性肝炎的关系密切，是病毒性肝炎所引起的最重要死亡原因之一，亦是 临床上最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内是位居第三的肿瘤相关致死原因，每年新发 病例中我国占全球42. 5%，已成为我国第二位的肿瘤病因。
[0003] 研究表明，HBV感染相关HCC患者中，HBV DNA载量高者（>105copies/ml)的HCC 发生率达10. 1%，而HBV DNA载量低者（<104copies/ml)的HCC发生率仅为3. 8%，基线高 病毒载量与HCC发生率升高有关。高病毒载量（HBV DNA彡0. 7mEq/ml)时，HCC复发危险 比为5. 13,切口缘阳性的HCC复发危险比为2. 14。因此，对乙肝患者进行抗病毒治疗，有助 于延缓疾病向HCC的进展。对HBV相关HCC患者进行抗病毒治疗，可通过改善肝功能而提 高生存率。近年的研究显示，高HBV DNA载量与高HCC复发率及预后不良有关。对HBV感 染相关HCC术后患者进行抗病毒治疗可能是除肝移植以外的另一种治疗选择，该治疗可通 过改善肝功能而提高生存率。
[0004] 目前针对HBV感染主要采用α -干扰素和核苷酸类似物等药物抗病毒治疗，但该 两类药物长期使用疗效欠佳，易于导致病毒突变，给治疗带来极大困难[2]。
[0005] 相对于抗病毒感染的药物，乙肝特异性的免疫球蛋白（HBIG)的抗病毒效果好很 多。给予病人乙肝特异性的免疫球蛋白（HBIG)治疗已给被各国的学者广泛关注。诸如， HBIG在乙肝来源的肝癌后肝移植后的研究已达到很好的效果。HBIG是一种高效价的多克 隆外源性抗体，其是从健康献血员中筛选出来，经过生物浓缩工艺制成。当人体感染HBV 时被动地接受这种被动免疫制剂，可使机体能短期内迅速中和并清除血清中游离的乙肝病 毒，避免乙肝病毒定位感染。
[0006] 然而，当前HBIG作为治疗性抗体的来源存在诸多非安全因素。同时，乙肝免疫球 蛋白成分复杂，危险因素相对不确定，生产方式受限，这些因素制约着乙肝治疗性抗体的临 床使用[3]。
[0007] 因此迫切需要研发一种安全有效及危险因素相对可控的生物制品替代人乙肝 免疫球蛋白，所以研发乙肝特异性人源基因工程抗体越来越受到关注。因单克隆抗体具 有特异性强、灵敏度高且易大规模生产等优点，故研发针对乙肝表面抗原（Hepatitis B surface Ag, HBsAg)的单克隆抗体，以期能够安全有效地中和HBV病毒，进而可能阻止HBV 的感染相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。
【发明内容】
[0008] 本发明利用Single cell RT-PCR单细胞抗体技术开发一株了抗乙肝病毒表面抗 原的全人源单克隆抗体A3D5，采用了以下技术方案：
[0009] 本发明提供的抗乙肝病毒表面抗原的全人源抗体A3D5，具有这样的特征，包括：重 链可变结构域，包含高变区OTR 1、⑶R2、⑶R3;以及轻链可变结构域，包含高变区⑶R/、 CDIV、CDR3'，其中，CDR丨的氨基酸序列为=Met-Tyr-Ala-Phe-Ser ;CDR2的氨基酸序 列为：Gly-Ile-Ile-Pro-Ser-Phe-Asp-Thr-Thr-Asn-Tyr-Ala-Gln-Lys-Phe-Gln-Cys ; CDR3的氨基酸序列为：Ser-Val-Ile-Thr-Asp-Leu-Asp-Thr-Val-Gly-Asn-Asp-Glu-Ser -Gly-Asp-Ala-Ser-Tyr-Tyr-Tyr-Met-Asp-Val ;CDR/ 的氨基酸序列为：Arg-Ser-Ser -Glu-Ser-Leu-Gln-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp ;CDR2'的氨基酸序列为： Ser-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro ;CDR3'的氨基酸序列为：Met-Gln-Ala-Leu-Glu-Thr-Pro-Phe-Thr0
[0010] 重链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，轻链可变结构域的氨基酸序 列如SEQ ID NO. 8所示。
[0011] 同时，抗体A3D5选自抗乙肝病毒表面抗原的单克隆抗体以及单克隆抗体片段中的 任意一种，该单克隆抗体片段为单克隆抗体的Fab片段或F(ab'） 2片段。
[0012] 进一步的，本发明还提供了一种针对乙肝表面蛋白的抗体片段，该抗体片段为抗 体A3D 5的Fab片段或F (ab'）2片段。
[0013] 进一步的，本发明提供了一种编码抗体A3D5的基因，编码重链可变结构域的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 5所示，编码轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0014] 进一步的，本发明提供了一种含有至少一个拷贝的上述基因的表达载体。
[0015] 进一步的，本发明提供了一种含有至少一个上述的表达载体的宿主细胞。
[0016] 进一步的，本发明提供了抗体A3D5或其Fab片段或F(ab'） 2片段在制备预防或治 疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的用途。所述药物或诊断试剂除包含抗体或抗体 片段外，还包含可药用赋形剂、稀释剂与载体中的任意一种。
[0017] 发明作用与效果
[0018] 本发明提供了一种抗乙肝病毒表面抗原的全人源抗体，实验表明其能够特异性结 合HBsAg蛋白，有较好的HBV中和活性，进而可能阻止HBV感染及其相关的肝炎、肝硬化及 肝癌的进程。同时，由于该抗体是从接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性 B细胞中克隆获得的全人源抗体，其具有较鼠源、嵌合及人源化抗体更低的免疫原性。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明全人源抗体A3D5特异性结合乙肝病毒表面抗原检测结果图；
[0020] 图2是本发明的合成肽在乙肝表面抗原（HBsAg)的位置示意图。
[0021] 图3是本发明的抗体A3D5在HBsAg结合表位结果图；
[0022] 图4是本发明的抗体A3D5影响HBsAg表达的定量检测结果图；
[0023] 图5是本发明的抗体A3D5影响HBV DNA拷贝数定量检测结果图；
[0024] 图6是本发明的抗体A3D5抑制肝癌细胞HBsAg的释放的结果图。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合实施例来对本发明进行进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。
[0026] 实施例不包括对传统方法的详细描述，如Overlapping PCR反应，限制性酶切 反应，将基因插入到质粒载体，将质粒引入宿主细胞的方法等。这样的方法对于本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如Sambrook， J. , Fritsch, E. F. and Maniais，Τ· (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual， 2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。且下述实施例中所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 试剂与材料
[0028] 淋巴细胞分离液，购自北京鼎国生物技术有限责任公司；Trizol试剂，购自 Invitrogen公司；无血清培养基EX-CELL 302,购自 SIGMA-ALDRICH公司；Goat anti-human kappa-HRP 购自 Invivogen 公司；
[0029] 实施例一：抗乙肝病毒表面抗原的全人源抗体A3D5的制备
[0030] 一、抗体轻链恒定区、重链恒定区基因的克隆及其载体的构建
[0031] 用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂提取总RNA，根据文献[4] 和文献[5]报道的序列分别设计引物采用QIAGEN OneSt印RT-PCR Kit扩增人抗体的重链 和轻链恒定区基因。将人抗体的重链和轻链恒定区基因分别连接到表达载体AbVec质粒 中，分别构建了抗体重链恒定区核苷酸载体IgG-AbVec质粒以及抗体轻链恒定区核苷酸载 体Ig κ -AbVec质粒，测序验证后确认获得了正确的克隆。其中，人抗体重链恒定区核苷酸 序列及氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2,人抗体轻链恒定区核苷酸序列及氨 基酸序列分别为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0032] 二、抗体重链