植物来源的β-隐黄素和其制备方法【专利说明】植物来源的（3-隐黄素和其制备方法[0001]发明背景发明领域[0002]本发明涉及高纯度的天然的隐黄素的浓缩物和其制备方法。更特别的，本发明提供隐黄素的浓缩物，其包含约10-80重量％的总的叶黄素（总的类胡萝卜素），反式-0-隐黄素的含量为所述总的叶黄素的约75-98重量％，剩余的包括玉米黄素、反式-辣椒红、胡萝卜素和微量的其他的类胡萝卜素。该浓缩物作为膳食补充剂对营养和促进健康的益处是特别有用的。[0003]本发明也提供从植物的含油树脂，特别从辣椒属的含油树脂中制备0_隐黄素的浓缩物的方法。该方法包括以下步骤：将含油树脂与醇溶剂混合，皂化叶黄素酯，洗涤和通过在硅胶柱上洗脱粗制的叶黄素粘稠浓缩物来纯化，和通过洗涤进一步地纯化以得到高纯度的反式隐黄素富集的浓缩晶体。[0004]发明背景[0005]类胡萝卜素代表最广泛分布的天然存在的脂溶性的色素类的一种，所述色素在植物中以及动物中赋予黄、红和橙色。这些色素在可见光谱的400-500nm范围吸收光，并具有常见的化学特征，聚-类异戊二烯结构，在分子中心部分的双键的长共辄链和环绕中心双键的近对称性。类胡萝卜素的基本结构可以通过许多方法修饰，例如通过环化末段基团和通过导入含氧官能团（0-H，C=0)来产生不包括顺式-和反式-异构体的超过600种化合物的大的家族。哺乳动物物种不合成类胡萝卜素，因此需要从膳食来源中例如水果和蔬菜和/或膳食补充剂中获得类胡萝卜素。[0006]类胡萝卜素被分类为烃类胡萝卜素和含氧类胡萝卜素（叶黄素），其中番茄红素和胡萝卜素为烃类胡萝卜素的重要成员，而单-羟基化的隐黄素属于含氧类胡萝卜素，而叶黄素、玉米黄素和虾青素被二羟基化。对称的胡萝卜素（0，胡萝卜素）的酶羟基化的生物合成途径导致形成0-隐黄素（00-胡萝卜-3-醇），然而以非对称的a-胡萝卜素（0，e-胡萝卜素）为原料的相同反应产生两种反应产物，g卩：a-隐黄素(0，e_胡萝卜_3'-醇）和zeinoxanthin(0，e-胡萝卜-3-醇）。通常，因为a-隐黄素和zeinoxanthin之间的光谱结构类似性，除非进行例如甲基化或碱催化的异构体化的化学反应，确认它们是困难的。另外，很多出版物中也错误地给出了这些物质的化学结构(请参见图1)。[0007]在哺乳动物的血浆和组织中检测到的20种类胡萝卜素中，和叶黄素、玉米黄素、胡萝卜素和番茄红素一起，隐黄素为被检测到的主要类胡萝卜素之一，这些物质一起占近90%的类胡萝卜素。（J.G.Bieri,E.D.Brown和J.C.Smith,DeterminationofindividualcarotenoidsinhumanplasmabyHPLC,J.Liq.Chromatogr.8,473-484，1985)。隐黄素，一种前维生素A，在膳食中发挥了重要作用，其最终在人体中转化为维生素A的活性形式（视黄醇），一种对视力、免疫功能和皮肤和骨骼健康重要的营养物。隐黄素具有主要的维生素前体（0-胡萝卜素）的维生素A活性的一半。另外，隐黄素在体内作为抗氧化剂发挥作用。Wingerath等（1995)研究了在摄取富含隐黄素酯的橘子汁浓缩物之后的隐黄素的吸收。在人类乳糜微粒和血清中检测到了大量的0-隐黄素（T.Wingerath,W.Stahl和H.Sies,Beta-cryptoxanthinselectivelyincreasesinhumanchylomicronsuponingestionoftangerineconcentraterichinBeta-cryptoxanthinArch.Biochem.andBiophys.，324,385-390,1995)。在志愿者中，来自红辣椒的含油树脂的胡萝卜素的生物利用性已经显示：在乳糜微粒中存在与玉米黄素对比较高量的胡萝卜素和隐黄素（A.Perez-Galvez,H.D.Martin,H.Siesandff.Stahl,Incorporationofcarotenoidsfrompaprikaoleoresinintohumanchylomicrons,J.Nutrition,89,787-793,2003)〇Burri等（2011)已经报道在类似的条件下，隐黄素的生物利用性看起来比胡萝卜素的生物利用性高7倍。因此，隐黄素有可能为维生素A的有价值的和潜在的来源，这需要进一步的研究和证实（B.J.Burri,S.Jasmine,T.Chang和T.R.Neidlinger,Beta-cryptoxanthin-andalpha-carotene-richfoodshavegreaterapparentbioavailabilitythan0-carotene-richfoodsinWesterndiets,Brit.J.Nutrition,105,212-219,2011)〇[0008]不同于其他类胡萝卜素，在大部分水果和蔬菜中没有发现P-隐黄素，但是其以少量存在于一些特定的食物中例如辣椒属的种、柑橘类的水果、芒果、番木瓜和南瓜，例如，以约10-20mg/100g存在于这些水果和蔬菜中。0-隐黄素主要以酯形式存在于红辣椒和桔的水果中。Breithaupt和Bamedi(2001)已经分析了大量的水果和蔬菜，并报道隐黄素酯的浓度水平。在红辣椒（17.lmg/100g)、橘子和甜橙中发现最高的酯浓度（Carotenoidestersinvegetablesandfruits:Ascreeningwithemphasison0-cryptoxanthinesters,J.Agric.49,2064-2070,2001)。之后，Breithaupt等在一个随机的、单盲的交叉研究中发现：对12名志愿者使用单次等同剂量的酯化的或非酯化的隐黄素，在所述志愿者中产生的血浆响应没有区别，这表明酯化的或非酯化的0_隐黄素具有相当的生物利用性。（D.E.Breithaupt,P.Weller,M.Wolters和A.Hahn,PlasmaresponsetoasingledoseofdietaryBeta-cryptoxanthinesterfrompapaya,Caricapapaya,ornon-esterifiedbeta-cryptoxanthininadulthumansubjects:acomparativestudy,Brit.J.Nutr.90,795-801，2003)。Takayanagi和Mukai(2009)通过使用酶的方法和与膳食纤维的联合开发了一种来自温州蜜柑的隐黄素的生物可用组合物（美国专利串请公开号2009/0258111，Highlybioavailableoraladministrationcompositionofcryptoxanthin)〇[0009]在大多数西方国家和日本，P_隐黄素的膳食来源来自于柑桔类水果和它们的产物，因此可以认为血浆隐黄素水平是水果食用量的良好的指数。类似的，在很多热带国家（例如，拉丁美洲）广泛食用的水果例如番木瓜中，已经报道水果食用量和血浆隐黄素的高相关性（M.S.Irwig,A.El-Sohemy,A.Baylin,N.Rifai和H.Campos,Frequentintakeoftropicalfruitsthatarerichinbeta-cryptoxanthinisassociatedwithhigherplasmabeta-cryptoxanthinconcentrationsinCostaRicanadolescents,J.Nutr.132,3161-3167,2002)。[0010]海藻、特别是铜藻（Sargassumhorneri)的提取物的水溶性提取物在年幼和年老的大鼠的体内和体外的股骨干骺端组织中显示对于骨钙化方面的合成作用，这表明其在预防骨质疏松中的作用（Yamaguchi等，Effectofmarinealgaeextractonbonecalcificationinthefemoral-metaphysicaltissuesofrats:AnaboliceffectofSargassumhorneri,J.HealthSci.，47,533-538,2001;Uchiyama和Yamaguchi，AnaboliceffectofmarinealgaSargassumhorneri，Effectonbonecomponentsinthefemoral-diaphysealandmetaphysealtissuesofyoungandoldratsinvivo,J.HealthSci.48,325-330,2002)。之后，在不同的类胡萝卜素的效果的一项研究中，0-隐黄素显示在体外的股骨干（骨皮质）组织和股骨干骺端（海绵骨）组织中显著增加的钙含量和碱性磷酸酶活性，表明隐黄素在体外具有对于骨钙化的独一无二的合成作用（Yamaguchi和Uchiyama，Effectofcarotenoidoncalciumcontentandalkalinephosphataseactivityinratfemoraltissuesinvitro:Theuniqueanaboliceffectofbeta-cryptoxanthin,Biol.Pharma.Bull.26,1188-1191,2003)〇在另一项研究中，发现骨组织中的DNA含量显著地增长，证明了隐黄素在大鼠骨组织（体外）中的骨-吸收的因素-诱导的骨质吸收的抑制效果（Uchiyama等，Anaboliceffectofbeta-cryptoxanthinonbonecomponentsinthefemoraltissuesofagedratsinvivoandinvitro,J.HealthSci.50,491-496,2004;Yamaguchi和Uchiyama,Beta-cryptoxanthinstimulatesboneformationandinhibitsboneresorptionintissuecultureinvitro,Mol.Cell.Biochem.258,137-144,2004)〇[0011]因此，e-隐黄素在保持骨健康和预防骨质疏松方面具有潜在的作用和效果。由Yamaguchi等进行的不同的研究（2004、2005、2006和2008)，已经证明规律的每日摄入温州蜜柑汁（柑橘）和/或具有0_隐黄素（3_6mg或更多/日）的营养剂在正常和健康的个体中和绝经的女性中具有有益的效果，例如对随年龄增长的骨丢失的预防效果、对骨形成的刺激效果和对骨再-吸收的抑制效果。（Prolongedintakeofjuice，Citrusunshiu，reinforcedwithbeta-cryptoxanthinhasaneffectoncirculatingbonebiomarkersinnormalindividuals,J.HealthSci.，50,619-624,2004;Relationshipbetweenserumbeta-cryptoxanthinandcirculatingbonemetabolicmarkersinhealthyindividualswiththeintakeofjuice(Citrusunshiu)containingbeta-cryptoxanthin.J.HealthSci.，51，738-743,2005;Effectofbeta-cryptoxanthinoncirculatingbonebiomarkersintakeofjuice(Citrusunshiu)supplementedwithbeta-cryptoxanthinhaseffectinmenopausalwomen,J.HealthSci.，52,758-768,2006;Beta_Cryptoxanthinandbonemetabolism:Thepreventionroleinosteoporosis,J.HealthSci.，54,356-369,2008)〇Uchiyama和Yamaguchi(2005&2006)报道在链脲霉素（糖尿病）和切除卵巢的大鼠的体内研究中，口服施用从温州蜜柑中分离的隐黄素具有对骨丢失的预防效果C3(Oraladministrationofbeta-cryptoxanthinpreventsbonelossinstreptozotocinratsinvivo,Biol.Pharm.Bull.28，1766-1769,2005;0raladministrationofbeta-cryptoxanthinpreventsbonelossinovariectomizedrats，Int.J.Mol.Med.17,15-20,2006)〇欧洲专利申请号058060229,公开。2007/35(作为欧洲专利公开EP1825858公开）涉及一种组合物，其包含隐黄素和锌，其用于促进骨生成、增加骨矿物质含量，由此预防骨疾病例如骨关节炎。（M.Yamaguchi,Compositionforpromotingosteogenesisandincreasingbonemineralcontent)。美国专利号8,148,431B2,2012年4月3日，证实隐黄素具有骨生成的促进效果、骨-吸收的抑制效果和对骨疾病的治疗效果(M.Yamaguchi,Osteogenesispromotercontainingbeta-cryptoxanthinastheactiveingredient)〇[0012]通常，不同的骨和关节疾病例如骨质疏松，、骨关节炎和风湿样关节炎在老年人中是常见的，并导致产生骨折的主要健康问题。随着年龄的增长，由于不同的膳食原因，存在骨量的下降和骨质吸收的增加。在近期的发表物中，Yamaguchi已经综述有关隐黄素在调节骨的内环境稳定和在预防骨质疏松的作用方面的近期发展，特别是细胞的和分子的机制，0_隐黄素通过这些机制来刺激成骨细胞的骨形成和抑制成骨细胞的骨质吸收(Beta-cryptoxanthinandbonemetabolism:Thepreventiveroleinosteoporosis,J.HealthSci.，54,356当前第1页1 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