-369, 2008;Roleofcarotenoidbeta-cryptoxanthiinbone homeostasis,J.Biomed.Sci.，19, 1-13, 2012) 〇
[0013] 在吸烟人群中发现高水平的隐黄素膳食摄入与肺癌的降低的风险有关， 由此表明叶黄素作为肺癌的化学-预防性药剂（Yuan等，Dietarycryptoxanthin andreducedriskoflungcancer:theSingaporeChinesehealthstudy,Cancer Epidemiol.BiomarkersPrev. 12, 890-898, 2003)。Craft等（2004)在脑的额皮质中发 现隐黄素，额皮质被认为与阿耳茨海默氏病有关，但是没有解释隐黄素确切的 作用(N.E.Craft,T.B.Haitema,K.M.Garnett,K.A.FitchandC.K.Dorey,Carotenoids ,tocopherolandretinolconcentrationsinelderlyhumanbrain,J.Nutr.Health Ageing, 8, 156-162, 2004)。0 -隐黄素的高血衆水平已经与抗类风湿关节炎的保护效果 相关。Pattison等（2005)将88名个体中发生的炎症性关节炎归因于隐黄素的低水 平的騰食摄入（D.J.Pattison,D.P.Symmons,M.Lunt,A.Welch,S.A.Bingham,N.E.Day和 A.J.Silman,Dietarybeta-cryptoxanthinandinflammatorypolyarthritis:results fromapopulationbasedprospectivestudy,Am.J.Clin.Nutri. 82, 451-455, 2005)〇 美 国专利申请公开号2008/0070980记载0 -隐黄素和其酯在制备组合物中的用途的方法， 所述组合物用于在人和动物中提供增加的蛋白质形成和/或预防蛋白质损失，从而导致 运动和体育锻炼活动中的增强的表现。（E.Anne,G.Resina,W.KarinandW.Adrian,Use ofbeta_cryptoxanthin，2008 年 3 月 20 日）?在近期标题为"Methodofimproving cardiovascularhealth"的美国专利申请中有以下发现，包含纯化的隐黄素（0.1 至20mg/日）的营养补充剂在降低高血压中是有效的，其在保持健康血压和心血管健康 中也是有效的。然而，所用的隐黄素是通过分析HPLC从a-隐黄素、无水叶黄素 (anhydroluteins)、玉米黄素，和其他杂质的混合物中纯化的。（美国专利申请公开号 2012/0053247, 2012 年 3 月 1 日公开，H.Showalter,Z.Defretas和L.Mortensen)。
[0014] 鉴于对P_隐黄素不同的健康益处的增加的研究兴趣，已经有数个方法商业化 地生产该类胡萝卜素：（1)从作为富含隐黄素的提取物的天然源，（2)通过生物技术途 径，和（3)通过全-合成和半-合成。不同的临床研究已经使用合成的隐黄素或富含 0 _隐黄素的天然的水果提取物。
[0015] 天然源提取物
[0016] Yamaguchi(2006)涉及从柑橘中分离0 -隐黄素的方法，其通过使用水解来萃 取色素，然后通过硅胶柱色谱法纯化分离隐黄素。该隐黄素级分通过十八烷基 娃酸盐二氧化娃（octadecylsilicatesilica)进一步地纯化以得到95%的隐黄素 (M.Yamaguchi,Osteogenesispromotercontainingbeta-cryptoxanthinasanactive ingredient,美国专利申请公开号2006/0106115,2006年5月18日公开）。Takahashi 和Inada(2007)已经通过溶剂萃取和水解从果肉/汁和果皮中制备美洲柿提取物来释 放0 -隐黄素（游离）。从果肉和果皮制备的提取物分别显示lmg/100g和8mg/100g的 隐黄素，和在功能性食品中的有用的应用（H.Takahashi和Y.Inada，美国专利申请公 开号 2007/0116818A, 2007 年 5 月 24 日公开，Extractcontainingbeta-cryptoxanthin fromPersimmonfruit)。Shirakura等（2008)以及Takayanagi和Mukai(2008)已经研 发酶处理的温州蜜柑（EPSM)提取物和乳化的桔提取物（EME)的商业化的制备方法，所述 温州蜜柑提取物和桔提取物分别包含0.2和0.05%的隐黄素。他们报道在人类比较 性试验中所述提取物降低内脏脂肪和血浆葡萄糖，该试验被设计为安慰剂-对照的双盲研 究（Y.S.Hirakura,K.Takayanagi和K.Mukai,Reducingeffectofbeta-cryptoxanthin extractedfromSatsumamandarinonhumanbodyfat,摘要，第 161 页；K.Takayanang和 K.Mukai,摘要：0-cryptoxanthinandSatsumamandarin:Industrialproductionand healthpromotingbenefits,第 73 页，CarotenoidScience, 2008 年 6 月 12 日，第 15 届 类胡萝卜素国际研讨会的摘要和论文（Abstractsofthepaperspresentedatthe15th InternationalSymposiumonCarotenoids),冲绳，日本，2008 年6 月 22 日至27 日）〇
[0017] 生物技术的生产
[0018] Serrato-Joya等（2006)已经以实验室规模的批量生产使用泥色黄杆菌ITC B008(FlavobacteriumlutescensITCB008)产生 隐黄素（O.Serrat〇-Joya，H.Jimenez-Islas,E.Botello-Alvarez,R.Nicomartinez,和J.L.Navarrete-Bolans,Process ofbeta-cryptoxanthin,aprovitaminAprecursorbyFlavobacteriumLutescens,J. FoodSci. 71，E314-E319, 2006)。Louie和Fuerst(2008)公开从微生物中制备 隐黄素 的方法，所述微生物通过来自拟南芥的胡萝卜素羟化酶基因转化，所述方法通过培养 转化体和回收0 -隐黄素来制备（美国专利申请公开号2008/0124755, 2008年5月29日 公开，Biosynthesisofbeta-cryptoxanthininmicrobialhostsusingArabidopsis thalianabeta-carotenehydroxylasegene)。再者，Louie和Fuerst(2009)公开 隐 黄素的制备方法，所述方法使用番茄红素单环化酶和将番茄红素经过Y-胡萝卜素 和3-羟基-y-胡萝卜素转化为隐黄素（M.Y.Louie和E.J.Fuerst，美国专利申请[0019] 没有微生物可以天然地产生作为最终产物的P_隐黄素，因此发酵工艺对商业化 生产是不可行的。另外，在发酵方法中生产的类胡萝卜素的浓度低，和所产生的类胡萝卜素 为产物的复杂混合物，其包含不同的加入的成分。大量的纯化步骤需要大量的溶剂和产生 相当多量的副产物。
[0020] 合成的生产
[0021] Khachik和其同事研发了三种制备隐黄素的方法。两种方法使用叶黄素或 叶黄素酯作为起始物质，并在酸的存在下将起始物质转化为无水叶黄素的三种形式：3-羟 基-3'，4' -二脱氢-0 -y-胡萝卜素（I)，3_羟基_2'，3'-二脱氢- 0-e-胡萝卜素 (II)和3-羟基-3'，-4' -二脱氢-0-0-胡萝卜素（III)。将富含脱水叶黄素（III) 的脱水叶黄素混合物经受在酸和氯化溶剂存在下的离子氢化来产生a-和隐黄 素。纯化的产物显示85%的总的类胡萝卜素，隐黄素占所述总的类胡萝卜素的55% 至61%，a-隐黄素占所述总的类胡萝卜素18至30 %，剩余的为3至8 %的R，R-玉 米黄素和未反应的无水叶黄素（F.Khachik，美国专利号7，115,786B2,2006年10月3 日，Methodforproductionofbeta-cryptoxanthinandalpha-cryptoxanthinfrom commerciallyavailablelutein；F.Khachik,A.N.Chang,A.GanaandE.Mazzola,Partial synthesisof(3R，6'R)-alpha-cryptoxanthinand(3R)- 0-cryptoxanthin from(3R，3'R，6'R)-lutein(J.Nat.Products70, 220-226, 2007))。
[0022] 在第二种方法中，将无水叶黄素的混合物通过使用氧化铝负载铂的催化氢化转 化为ct-和隐黄素。最终产物为微红色晶体，其60%为总的类胡萝卜素和HPLC成分显 示以3:1、7:3,或5:1比例存在的隐黄素和a-隐黄素，和存在未反应的无水叶黄素I 和II以及R，R-玉米黄素。
[0023] 在第三种方法中，该方法用于合成光学活性的3-羟基-0-紫香酮和使 用维蒂希偶合反应将其转化为隐黄素。该合成方法包括多步骤反应和导致产 生0 _隐黄素和R，R-玉米黄素混合物的纯化（F.Khachik和A.N.Chang,美国专利 申请公开号 2009/0311761,2009 年 12 月 17 日公开，Processforsynthesisof 3(S)-and(3R)-3-hydroxy-0-iononeandtheirtransformationtozeaxanthin andbeta-cryptoxanthin；Synthesisof(3S)-and(3R)-hydroxy-0-iononeandtheir transformationinto(3S)-and(3R)-beta-cryptoxanthin,Synthesis3, 509-516, 2011)〇
[0024] 本发明
[0025] 如通过以上讨论证明的，生产隐黄素的现有技术具有一些限制。当隐黄 素的天然源可用时，迄今为止只在水果饮品中例如橘子、柑橘和柿子中已经生产了富含形 式的提取物。使用生物技术的途径来生产隐黄素还在初步的研发中，其迄今为止限定 于具有低产率的实验室规模的生产。合成方法产生隐黄素的混合物和相当大量的杂质 例如a-隐黄素，所述杂质最有可能为zeinoxanthin(非-原维生素A),以及未-反应的 无水叶黄素和玉米黄素。采用Khachik和其同事的方法，隐黄素的分离是复杂的，该分 离包括多个步骤，且并非商业可行。因此，存在对高纯度的天然隐黄素的浓缩物和其生 产方法的需要。
[0026] 根据无水叶黄素II(3-羟基-2'，3' -二脱氢，e-胡萝卜素）的化学结构， 技术人员将期望在2'，3'-双键氢化以形成26；[11(?3111：11；[11(0，￡-胡萝卜-3-醇）。另外， 技术人员不会期望通过碱异构体化将zeinoxanthin转化为0 -隐黄素，因为不存在稀丙基 羟基基团。这已经由以下证实：对包含10%zeinoxanthin(通过HPLC测定）的隐黄 素在高温下（ll0°C)进行苯甲醇碱催化的反应，反应后所得产物显示对比对照，其HPLC图 没有变化。事实上，所谓的a_隐黄素的碱催化的反应没有获得0 _隐黄素（F.Khachik，A. N.Chang,A.Gana和E.Mazzola,Partialsynthesisof3(R, 6'R)-alpha-cryptoxanthin and(3R)-0-cryptoxanthinfrom(3R，3R'，6'R)-lutein,J.Nat.Prod. 70, 220-226, 2007) 0
[0027] 本领域技术的综述证明高纯度的P_隐黄素的普遍的不可用性，所述P_隐黄素 以相当大的量生产，其作为从天然源中得到的主要成分被用作营养成分并在膳食补充剂中 使用。源自天然源的隐黄素（特别是水果和蔬菜）的不可用性的首要原因是其在天然 源中的低浓度，这阻碍通过常规的基于溶剂的萃取程序来商业化方法获得这种分子。确定 提供商业可用的高纯度的0 _隐黄素的浓缩物的来源和方法将有助于满足对这种产品的 需要，并帮助确立隐黄素在临床试验中以及其作为膳食补充剂的潜在的健康益处。辣 椒属萃取物具有相当高含量的隐黄素，但是也有很多其他包含隐黄素的物质的有 前途的选择。本发明满足本领域的需要和提供源自植物含油树脂，特别是辣椒属的含油树 脂中的天然的高纯度的隐黄素的浓缩物，和其制备方法。另外，这些天然的隐黄素 的浓缩物可以被用来提供一些健康益处，例如在骨丢失和骨质疏松中的健康益处。
[0028] 骨量随年龄增长而减少。这种减少是由于增加的骨质吸收和减少的骨 生成造成的。骨量的减少诱导骨质疏松（M.Yamaguchi,S.Uchiyama,K.Ishiyama, 和K.Hashimoto,OralAdministrationinCombinationwithZincEnhances Beta-cryptoxanthin-InducedAnabolicEffectsonBoneComponentsintheFemoral TissuesofRatsInVivo,Biol.Pharm.Bull. 29 (2) 371 - 374 (2006))。通过成骨细胞的 骨生成和折骨的骨质吸收之间的平衡保持骨动态平衡（M.Yamaguchi,RoleofCarotenoid Beta-CryptoxanthininBoneHomeostasis,JournalofBiomedicalScience 19-36(2012))。雌激素的产生在绝经期减少，其导致新陈代谢的失调（Citrusunshiu extract.HealthIngredientforpreventionofosteoporosishealthingredientfor whiteningandaestheticingredientforcosmetic,Productmonograph,Ver. 3.OHSby OryzaOil&FatChemicalCoL