抗卵巢癌单抗coc166-9的对应抗原及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗卵巢癌单抗C0C166-9的对应抗原及其应用，具体而言，本发明涉及 抗卵巢癌单抗C0C166-9的对应抗原（本发明中将其命名为CA166-9)的克隆鉴定及其在判 断卵巢癌预后及卵巢癌治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，虽然其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体 癌而列居第三位，但因卵巢癌致死者却居首位，对妇女的生命造成了严重威胁。目前在全球 范围内，卵巢癌的发病率仍在逐年增加。由于卵巢的胚胎发育，组织解剖及内分泌功能较复 杂，它所患的肿瘤可能是良性或者是恶性。由于卵巢癌临床早期无症状，鉴别其组织类型及 良恶性在临床也存在一定困难，临床上诊断的卵巢癌大部分已经扩散到子宫双侧附件、大 网膜及盆腔各器官，其五年生存率仅25%~30%。目前传统的预后指标（如肿瘤大小、临 床分期（TNM)、病理分型、组织分级）不能完全正确判断卵巢癌患者的预后情况，因而导致 对部分病人的治疗不当，因此，需要寻找更可靠的指标单独或结合其它指标，用于判断患者 预后情况，以选择个体化的治疗方案。
[0003] C0C166-9是北京大学人民医院妇科肿瘤中心在上世纪八十年代用上皮型卵巢 癌组织粗提液免疫小鼠后经细胞融合制备获得的一株单克隆抗体，其与卵巢癌有较好的 组织反应特异性（钱和年，抗卵巢上皮癌相关抗原单克隆抗体C0C166-9的制备.北 京大学学报（医学版），1987(4):?.35-37)。单抗0)(：166-9在卵巢癌的表达率在75% 以上，与正常和非肿瘤组织极少发生交叉（张春玲，卵巢癌单抗免疫组化诊断试剂盒 制备的研究.浙江肿瘤，1995.1(l):p.8-9)。其与同位素的交联物能明显延长荷瘤小 鼠的生存期（李小平，卵巢癌C0C166-9单克隆抗体片段的制备及其在放射免疫显像 中的应用.中华妇产科杂志，1997. 32 (3) :p. 152-155)。用该抗体制备获得的抗独特 型抗体（Ab2)6Bll能成功诱导出淋巴细胞对卵巢细胞的有效杀伤作用（Chang，X.，et al. ,Preparationofhumanizedovariancarcinomaanti-idiotypicminibody. HybridHybridomics, 2003. 22(2) :p. 109-15 ;昌晓红，卵巢癌 6B11 抗独特型微抗体诱 导抗肿瘤免疫应答的体外实验.北京大学学报（医学版），2005. 37(5) :p. 480-484)，并 能诱导产生可与卵巢癌细胞特异结合的抗抗独特型抗体（Ab3)(倪俊，卵巢癌单克隆 抗-抗独特型抗体32F2的制备及其特性研究.中国妇产科临床杂志，2007. 18 (6) :p. 448 ; 张超，卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体3D12的制备及初步研究.北京大学学报（医学 版），2008. 40(2) :p. 170-173)。通过与上海生源医药研究有限公司的合作，目前已完 成对具抗原内影像的抗独特型抗体6B11的微型化改造及临床前相关研究的主要工作 (张果，卵巢癌抗独特型单链抗体6BllScFv/鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究.中 国医药生物技术，2009.4 (6):p. 424-429 ;Cui,H.，etal.，Theanti-tumorimmune responsesinducedbyafusionproteinofovariancarcinomaanti-idiotypic antibody6B1IScFvandmurineGM-CSFinBALB/cmice.IntJGynecol Cancer, 2004. 14(2):p. 234-41 ；Shi,J. ,etal.,Expressionofanovariancancer anti-idiotypeantibody(6B11VLVHCH3)inChinesehamsterovary(CHO)cellswith improvedimmunoactivityandstabilityoverproteinsexpressedinprokaryotic cells.Hybridoma(Larchmt), 2007. 26 (5) :p. 289-95)，并拟作为卵巢癌疫苗试用于临床。 [0004]然而，虽然单抗C0C166-9对卵巢癌有良好的反应特异性和敏感性，无论是与同位 素的标记物或是与免疫毒素的偶联物，还是源自C0C166-9的小分子抗独特型疫苗，均展示 出良好的潜在临床应用前景，但由于其对应抗原分子（CA166-9)迄今尚未获得克隆和鉴 定，阻碍了它在临床的应用，同时也严重影响了相关产品的进一步开发和对其相关分子机 制的研究。
【发明内容】
[0005] 本申请的一个目的在于鉴定抗卵巢癌单抗C0C166-9的对应抗原（本发明中将 "C0C166-9的对应抗原"命名为"CA166-9"），并提供其相关功能。
[0006] 本案发明人通过亲和层析、质谱鉴定和多种免疫学方法的相互验证，确定了单抗 C0C166-9的对应抗原（CA166-9)为人免疫球蛋白gamma-1重链恒定区样（IGHGl)蛋白，并 通过卵巢癌细胞的表型实验初步探讨了CA166-9的生物学功能。
[0007] 本发明提供了单抗C0C166-9的对应抗原CA166-9。根据本发明的具体实施方案， 所述的CA166-9包括如下（a)、（b)或（c)所示的蛋白或其免疫性片段：
[0008] (a)由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段；或
[0009] (b)与（a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与（a) 具有相同功能的由（a)衍生的蛋白或其免疫性片段；
[0010] (C)在（a)限定的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上同 源性且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白或其免疫性片段。
[0011] 本发明还提供了编码CA166-9的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多 核苷酸序列优选包括SEQIDNo. 1第1-597位所示的多核苷酸序列。
[0012] 本发明中，综合运用亲和层析、MALDI-T0F-MS质谱分析、不同的免疫竞争抑制实 验、抗原克隆和表达产物的鉴定分析等方法，对CA166-9进行了纯化、分析、鉴定和多角度 的验证。其中，通过免疫细胞化学（ICH)等实验，确定了SK0V-3、Caov-3细胞为C0C166-9 对应抗原的阳性细胞系，而在后续的WesternBlot和免疫沉淀实验中，在这些阳性细胞里 并没有检测到与单抗C0C166-9特异性反应条带，提示C0C166-9对应抗原蛋白在细胞中 的表达丰度较低，尚不足以用一般的免疫沉淀和WesternBlot检测到。本发明将大量的 Caov-3细胞（约2XIO9)总蛋白通过免疫亲和层析柱纯化后，成功捕获了三条能够与单抗 C0C166-9特异性结合的条带，为Caov-3细胞总蛋白来源的C0C166-9对应抗原的成功纯化 提供了保证。进一步地，对纯化抗原蛋白经酶解之后，将酶解肽段进行MALDI-T0FMS质谱 分析，其中有数条肽段经肽指纹图谱比对后与人免疫球蛋白ga_a-l重链恒定区部分序列 匹配，其肽段吻合率达到了 39. 7%以上。为了验证纯化的抗原确为单抗C0C166-9的对应抗 原，本发明通过竞争酶联免疫吸附实验、竞争免疫组织化学实验、竞争免疫细胞化学实验等 不同方法证明，纯化的抗原蛋白确实可竞争抑制C0C166-9与卵巢癌病人腹水蛋白、卵巢癌 组织和卵巢癌细胞蛋白中相关蛋白的结合。为进一步验证鉴定纯化抗原，本发明用纯化抗 原免疫小鼠制备获得了相应的抗血清，通过不同的免疫学实验表明，用纯化抗原免疫小鼠 获得的抗血清与单抗C0C166-9有同样的免疫反应特性；而从与C0C166-9反应阳性的卵巢 癌细胞Caov-3中克隆的人免疫球蛋白ga_a-l样重链的恒定区，其原核或真核表达产物也 均能被C0C166-9所识别。这些结果充分表明，单抗C0C166-9的对应抗原为人免疫球蛋白 gamma-1重链样蛋白（IGHGl)。
[0013] 本发明中，还用单抗COC166-9对111例具有五年以上随访资料的卵巢癌标本进行 了免疫组化检测及统计分析，结果表明，卵巢癌组织的CA166-9表达阳性率为53. 1 %，并与 肿瘤复发具有显著的相关性（P〈〇. 001) !Kaplan-Meier单因素结果显示，CA166-9表达阳性 患者的总生存期和无病生存期均显著低于表达阴性患者（P= 0. 026;P= 0. 002) ;Cox多因 素分析显示，CA166-9可作为影响卵巢癌患者总生存率（HR= 2. 145,P= 0. 027)和无病生 存率（HR= 2. 383,P= 0. 013)的潜在独立预后指标。从而，本发明提供了CA166-9作为影 响卵巢癌患者总生存率和无病生存率的预后指标中的应用，也提供了针对检测CA166-9在 卵巢癌组织中的表达的试剂在制备用于卵巢癌病人预后判断的检测剂中的应用。
[0014] 本发明中，还研究了CA166-9对卵巢癌细胞系表型的影响，结果表明单抗 C0C166-9能抑制抗原表达阳性卵巢癌细胞Caov-3的体外增殖、迀移和侵袭能力，而对抗原 表达阴性的卵巢癌细胞HOClA和人内皮细胞HMEC的增殖、迀移和侵袭能力无明显作用。外 源性表达纯化的抗原能促进抗原表达阴性卵巢癌细胞HOClA在体外的增殖、迀移和侵袭的 能力；而对抗原表达阳性的卵巢癌细胞Caov-3和表达阴性的人内皮细胞HMEC的相关表型 无明显影响。从而，本发明还提供了CA166-9在制备促进肿瘤细胞的增殖和/或迀移侵袭 的制剂中的应用，也提供了拮抗CA166-9的拮抗剂（例如抗体）在制备抑制肿瘤细胞生长 和/或迀移侵袭能力的制剂中的应用。本发明的抗原可作为疫苗用于卵巢癌的防治。从 而，本发明还提供了所述CA166-9蛋白或其免疫性片段在制备卵巢癌治疗性蛋白疫苗制剂 中的应用。本发明还提供了编码所述CA166-9蛋白的核苷酸序列在制备卵巢癌治疗性核酸 疫苗制剂中的应用。
【附图说明】
[0015] 图1 :抗原的亲和层析分离纯化峰图。其中，图片A为腹水抗原洗脱液0D2S。峰图， 图片B为Caov-3细胞总蛋白抗原洗脱液OD2fffl峰图。
[0016] 图2:WesternBlot鉴定单克隆抗体C0C166-9与纯化抗原的反应结果。其中，图 片A:1为抗原蛋白溶液上样，正常小鼠IgG为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗；2为抗原 蛋白溶液上样，单抗C0C166-9为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗；3为抗原蛋白溶液上 样，BSA蛋白为一抗，HP标记的羊抗人IgG为二抗。图片B:1为Caov-3细胞总蛋白纯化抗 原Iyg上样，单抗C0C166-9为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗；2为卵巢癌腹水纯化抗 原Iyg上样，单抗C0C166-9为一抗，HP标记的羊抗鼠IgG为二抗。a、b、c、d、e为与单抗 C0C166-9特异反应条带。
[0017]图3 :亲和层析纯化抗原的考马斯亮蓝染色结果。其中，图片A为Caov-3细胞总 蛋白纯化抗原，图片B为卵巢癌腹水纯化抗原。a、b、c、d、e为与单抗C0C166-9特异反应条 带。
[0018]图4 :纯化抗原指纹图谱的分析结果。其中，图片A:卵巢癌腹水纯化抗原质谱峰 图；图片B:IGHG1蛋白的吻合肽谱图，红色的序列即为吻合肽。
[0019] 图5 :纯化抗原和人IgG的ELISA竞争抑制实验结果。结果显示，0.5yg/ml纯化 抗原或0. 5yg/ml人IgG可有效抑制单抗C0C166-9与包被卵巢癌腹水蛋白的结合，而小鼠 IgG无抑制作用。
[0020] 图6 :纯化抗原和人IgG的免疫组化克争抑制实验结果。结果显不，Iyg/ml纯化 抗原或Iyg/ml人IgG可有效抑制单抗C0C166-9与卵巢癌组织的结合，而小鼠IgG无抑制 作用。
[0021] 图7 :用ProteinA直接进行免疫沉淀鉴定单抗C0C166-9抗原的结果。其中，al: 经ProteinA吸附后的纯化抗原蛋白溶液，bl:纯化抗原与ProteinA的结合蛋白；a2 :经 ProteinA吸附后的正常人IgG蛋白溶液，b2 :正常人IgG与ProteinA的结合蛋白。
[0022] 图8 :免疫小鼠多抗血清的ELISA检测结果。
[0023] 图9:免疫小鼠多抗血清的免疫组化和免疫细胞化学检测结果。其中，图片A:免疫 小鼠多抗血清的免疫组化检测；图片B:免疫小鼠多抗血清的免疫细胞化学检测。
[0024] 图10 :2个不同克隆的IGHGl样蛋白的cDNA比对。
[0025] 图11 :pGEX-4T-l-IGHGl重组质粒的构建及其表达产物与单抗C0C166-9的反应 检测结果。其中，图片A:l%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物：M为DNAmarker;1-6 为PCR扩增产物，扩增出约600bp目的片段；图片B:pGEX-4T-l-IGHGl重组质粒的酶切鉴 定：M为DNAmarker，l-5为不同克隆，用BamHI/XholI双酶切，释放约600bp目的片段； 图片C:原核表达IGHGl蛋白的诱导表达，1-3为诱导表达全菌，其IPTG诱导浓度分别为 0. 25, 0. 5,IyM，4为未诱导全菌，如箭头所示在55KD处有诱导蛋白表达；图片D:原核表达 IGH