5与DFS和OS均没有相关性（表2)。
[0159] 表2单因素分析临床病理学参数及CA166-9与生存期（OS与DFS)的相关性
[0160]
[0161] 将单因素分析的所有因素纳入Cox比例风险模型进行多因素分析，结果显示 CA166-9仍然是总生存率（OS)及无病生存率（DFS)的独立预后因素，风险系数分别为：HR =2. 454,95%CI：0. 825-2. 563,P= 0. 016(0S)；HR= 2. 331,95%Cl：1. 383-3. 929,P= 0. 021 (DFS)。此外，肿瘤大小、复发和临床分期也是影响患者生存的独立预后指标，三者风 险系数分别为1. 284、7. 808和2. 026 (OS)，1. 740、7. 137和2. 886 (DFS)，可见复发对卵巢癌 患者总生存期的影响大于CA166-9表达对生存期的影响，它和一些其它未知因素共同作为 卵巢癌的预后因素对卵巢癌病人的预后产生影响（表3)。
[0162] 表3多因素分析临床病理学参数及CA166-9与生存率的相关性
[0165] 实施例3 :CA166-9对肿瘤细胞表型的影响
[0166] 人乳腺内皮细胞HMEC由北京市肿瘤防治研究所生化室保存；人卵巢癌细胞系 SK0V-3, Caov-3,3A0由北京大学人民医院妇科肿瘤中心保存提供。HOClA为北京大学人民 医院妇科肿瘤中心建立人永生化卵巢癌细胞系。TranswellChamber购自CorningCo.，型 号 3422。Matrigel?(Lot:354234)购自BDCo.。
[0167] 利用SPSS15.0软件进行统计学分析，组间差异利用方差分析，组内差异利用双侧 t检验进行统计分析。
[0168](一）细胞增殖实验
[0169] 将细胞消化后铺96孔板，根据细胞的生长速度和体积大小选择合适的接种细胞 数，一般每孔细胞数2000~5000个。细胞贴壁生长后，加入纯化抗原或单抗C0C166-9使 其终浓度为10yg/mL，正常人IgG或正常小鼠IgG作为阴性对照，继续培养。继续培养4h 后，吸弃其培养孔中的培养基（不要搅动或吸弃细胞），加入150yLDMS0,室温放置15min， 并不时震荡（使甲瓒蓝充分溶解），测其OD492值，作生长曲线分析。
[0170] 1单抗C0C166-9能抑制抗原表达阳性卵巢癌细胞的增值能力
[0171] 利用抗原表达阳性卵巢癌细胞SK0V-3、Caov-3和抗原阴性卵巢癌细胞3A0、H0C1A 以及人内皮细胞HMEC进行增殖实验。
[0172] 将生长状态良好的细胞消化后接种于96孔，每孔2500个细胞。细胞贴壁生长后， 加入单抗C0C166-9使其终浓度为10yg/mL，正常小鼠IgG作为阴性对照，继续培养。分别 于24h、48h、72h、96h和120h时进行MTT分析。每个处理组设3个平行孔，实验重复2次。
[0173] 实验结果表明，抗原阳性细胞SK0V-3、Caov-3在加入单抗C0C166-9后，细胞生长 均减慢，表明单抗C0C166-9对IGHGl阳性细胞Caov-3(P〈0. 01)和SK0V3(P〈0. 05)生长具 有抑制作用。而抗原阴性细胞3A0、H0C1A，以及人内皮细胞HMEC加入单抗C0C166-9后与 阴性对照组生长速度没有区别，表明单抗C0C166-9对抗原阴性卵巢癌细胞3A0、H0C1A，以 及人内皮细胞HMEC的增值作用没有影响（图15)。
[0174] 2纯化抗原CA166-9能促进抗原表达阴性卵巢癌细胞的增值
[0175]同上，利用抗原阳性卵巢癌细胞SK0V-3、Caov-3和抗原阴性卵巢癌细胞3A0、 HOClA以及人内皮细胞HMEC进行增殖实验。
[0176] 将生长状态良好的细胞消化后接种于96孔，每孔2500个细胞。细胞贴壁生长后， 加入纯化抗原CA166-9使其终浓度10yg/mL，正常人IgG作为阴性对照，继续培养。分别于 24h、48h、72h、96h和120h时进行MTT分析。每个处理组设3个平行孔，实验重复2次。结果表 明，抗原阴性卵巢癌细胞3A0、HOClA在加入纯化抗原CA166-9后，与正常人IgG组相比，细 胞生长速度有所增加，表明加入纯化的抗原CA166-9对抗原阴性卵巢癌细胞3A0(P〈0. 05)、 H0C1A(P〈0.05)生长具有促进作用。而抗原阳性卵巢癌细胞SK0V-3、Caov-3以及人内皮细 胞HMEC加入纯化抗原CA166-9后，与对照组生长速度没有区别，表明纯化抗原CA166-9对 抗原阳性卵巢癌细胞SK0V-3、Caov-3以及人内皮细胞HMEC的增值作用没有影响（图16)。
[0177](二）Transwell细胞迀徙实验
[0178] 将3组细胞（1个空载，2个SNCG细胞系），当细胞密度达到80%，且生长状态良好 时，以无血清培养液洗涤细胞两次，消化待检测细胞，无血清培养基稀释并进行细胞记数， 调整细胞浓度为1.5X105/ml。取出37°C温育的Chamber，下室加入800yl含10%血清的 培养液，上室加入150y1待测细胞悬液，加入纯化抗原IGHGl或单抗C0C166-9使其终浓度 为10yg/mL，正常人IgG或正常小鼠IgG作为阴性对照，于37°C，5 %C0J?箱中继续培养 36hr。弃去上室培养液，将小室轻轻取出，用湿棉签擦去小室内部膜表面未侵袭的细胞。甲 醇室温固定30min。结晶紫染色30min，清水漂洗2次，室温干燥。滴一滴中性树胶，盖上盖 玻片，封片保存。200倍显微镜视野下观察，随机取5个视野进行细胞记数。重复实验2次。
[0179] 1单抗C0C166-9能抑制抗原阳性卵巢癌细胞的迀移能力
[0180] 利用抗原阳性卵巢癌细胞Caov-3，抗原阴性卵巢癌细胞HOClA及人内皮细胞HMEC 进行细胞体外迀移实验。
[0181] 将Matrigel将生长状态良好的细胞消化后悬浮于无血清培养液中，垂直加入 Chamber的上室内进行培养。在温箱培养Ih后，加入单抗C0C166-9使其终浓度为10yg/ mL，正常小鼠IgG作为阴性对照，继续培养。24小时后固定染色，实验重复2次。实验结果显 示，抗原阳性细胞Caov-3在加入单抗C0C166-9以后，细胞体外迀移能力减弱（304±28. 3vs 139± 12. 9,P〈0. 05)，表明单抗C0C166-9对抗原阳性细胞Caov-3的体外迀移能力具有抑 制作用。而抗原阴性细胞H0ClA(69±7.3vs71±5.5)和人内皮细胞HMEC(114±2.3vs 103±4.6)在加入单抗C0C166-9以后与阴性对照组的迀移能力没有区别，表明单抗 C0C166-9对抗原阴性卵巢癌细胞HOClA和人内皮细胞HMEC的体外迀移能力没有影响（图 17)。
[0182] 2纯化抗原CA166-9能促进抗原阴性卵巢癌细胞的体外迀移
[0183] 同上，利用抗原阳性卵巢癌细胞Caov-3，抗原阴性卵巢癌细胞HOClA及人内皮细 胞HMEC进行细胞体外迀移实验。
[0184] 将生长状态良好的细胞消化后悬浮于无血清培养液中，垂直加入Chamber的上室 内进行培养。在温箱培养Ih后，加入纯化抗原使其终浓度为10yg/mL，正常人IgG作为组间 对照，继续培养。24小时后固定染色，实验重复2次。实验结果如图18,抗原阴性卵巢癌细 胞3A0、HOClA在加入纯化抗原以后，细胞体外迀移能力有所增强，表明抗原对阴性卵巢癌 细胞H0C1A(45±11. Ivs 67±15. 4，P〈0. 05)的体外迀移能力具有促进作用。而阳性卵巢癌 细胞Caov-3(86±6. 2vs 97±7. 7)以及人内皮细胞HMEC(152±11. Ivs 143±15. 4)在加入 纯化抗原以后与阴性对照组的迀移能力没有区别，表明纯化抗原对阳性卵巢癌细胞Caov-3 以及人内皮细胞HMEC的体外迀移能力没有影响。
[0185](三）Transwell细胞体外侵袭实验
[0186] 将Matrigel在4°C过夜融化。用4°C预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓 度lmg/mL，稀稀释过程在冰上操作。在Chamber的上室底部中央垂直加入100yL稀释过后 的Matrigel，37°C温浴4-5h使其干燥成为胶状。后续步骤同迀移实验。
[0187] 1单抗C0C166-9能抑制抗原阳性卵巢癌细胞的侵袭能力
[0188] 细胞与基底膜间的相互作用是调控细胞行为的重要因素之一。Matrigel是一种 可溶性的基底膜基质，它可以模拟类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质。利用抗 原阳性卵巢癌细胞Caov-3,阴性卵巢癌细胞HOClA及人内皮细胞HMEC进行细胞体外侵袭 实验。将Matrigel铺在Chamber上室的膜上并使其凝成固状，其余步骤同迀移实验，实 验重复2次。实验结果显示，阳性细胞Caov-3在加入单抗C0C166-9后细胞侵袭能力减 弱，表明单抗C0C166-9对抗原表达阳性细胞Caov-3(121±10. 5vs 57±5. 9，P〈0. 05)的 体外侵袭能力具有抑制作用。而阴性细胞H0ClA(127±7.4vs 108±9.2)和人内皮细胞 HMEC(101±3. 4vs 96±4. 9)在加入单抗C0C166-9以后与阴性对照组的侵袭能力没有区 另IJ，表明单抗C0C166-9对阴性卵巢癌细胞HOClA和人内皮细胞HMEC的体外侵袭能力没有 影响（图19)。
[0189] 2抗原CA166-9能促进阴性卵巢癌细胞的体外侵袭能力
[0190] 同上，利用IGHGl阳性卵巢癌细胞Caov-3,IGHGl阴性卵巢癌细胞HOClA及人内 皮细胞HMEC进行细胞侵袭实验。实验过程同上，加入纯化抗原CA166-9组使其终浓度为 10yg/mL，正常人IgG和未给药组作为组间对照，实验重复2次。实验结果如图20,阴性卵 巢癌细胞HOClA在加入纯化抗原CA166-9以后，细胞体外侵袭能力有所增强，表明纯化抗 原CA166-9对IGHGl阴性卵巢癌细胞HOClA(25 ±2.Ivs46 ±2. 3,P〈0. 05)的体外侵袭能力 具有促进作用。而IGHGl阳性卵巢癌细胞Caov-3 (58 ±2. 5vs64±3. 3)，以及人内皮细胞 HMEC(122±8. 6vs119±11. 3)在加入纯化抗原CA166-9以后与阴性对照组的侵袭能力没 有区别，表明纯化抗原CA166-9对阳性卵巢癌细胞Caov-3和人内皮细胞HMEC的体外侵袭 能力没有影响。
【主权项】
1. 如下（a)、（b)或（c)所示的蛋白或其免疫性片段： (a) 由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段；或 (b) 与（a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与（a)具有 相同功能的由（a)衍生的蛋白或其免疫性片段； (c) 在（a)限定的氨基酸序列具有80%以上同源性且具有相同功能的由（a)衍生的蛋 白或其免疫性片段。2. 编码权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列 优选包括SEQ ID No. 1第1-597位所示的多核苷酸序列。3. 权利要求1所述蛋白或其免疫性片段作为抗卵巢癌单抗C0C166-9的抗原的应用。4. 权利要求1所述蛋白作为影响卵巢癌患者总生存率和无病生存率的预后指标中的 应用。5. 针对检测权利要求1所述蛋白或其免疫性片段在卵巢癌组织中的表达的试剂在制 备用于卵巢癌病人预后判断的检测剂中的应用。6. 权利要求1所述蛋白或其免疫性片段在制备促进肿瘤细胞的增殖和/或迀移侵袭的 制剂中的应用；优选地，所述肿瘤细胞为C0C166-9抗原表达阴性细胞。7. 拮抗权利要求1所述蛋白或其免疫性片段的拮抗剂在制备抑制肿瘤细胞生长和/或 迀移侵袭能力的制剂中的应用；优选地，所述拮抗剂为抗体。8. 根据权利要求7所述的应用，其中，所述肿瘤细胞为C0C166-9抗原表达阳性细胞。9. 权利要求1所述蛋白或其免疫性片段在制备卵巢癌治疗性蛋白疫苗制剂中的应用。10. 编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列在制备卵巢癌治疗性核酸疫苗制剂中的应 用；所述的多核苷酸序列优选包括SEQ ID No. 1第1-597位所示的多核苷酸序列。
【专利摘要】本发明涉及抗卵巢癌单抗COC166-9的对应抗原及其应用，具体而言，本发明涉及抗卵巢癌单抗COC166-9的对应抗原(CA166-9)的克隆鉴定及其在判断卵巢癌预后及防治中的应用。本发明的研究表明，单抗COC166-9可用于对卵巢癌患者预后的判断；单抗COC166-9的对应抗原为IGHG1样蛋白，能促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，在卵巢癌的肿瘤发生发展中可能起重要作用。该抗原也有可能作为疫苗用于卵巢癌的防治。
【IPC分类】A61K39/00, G01N33/577, C12N15/12, A61P35/00, A61K48/00, C07K14/47, G01N33/574, A61K39/395
【公开号】CN105085648
【申请号】CN201510221286
【发明人】寿成超, 崔恒, 纪方兴, 昌晓红, 孟麟
【申请人】北京市肿瘤防治研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年5月4日