空肠弯曲菌免疫pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测空肠弯曲菌的免疫PCR检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 空肠弯曲菌（Campylobacterjejunienteritis)是 1973 年Butzler等自腹泻病 人粪便中分离出来，目前已认识其为人类腹泻的主要致病菌之一。空肠弯曲菌肠炎的发病 率在发达国家超过细菌性痢疾，在发展中国家发病率几乎等同于细菌性痢疾。本菌作为重 要的食源性致病菌，随着食物进入肠道后在含微量氧环境下迅速繁殖，主要侵犯空肠、回肠 和结肠，侵袭肠粘膜，造成充血及出血性损伤，近年来观察到有些菌株能产生类似霍乱肠毒 素，引起肠腔内液体分泌增加。目前空肠弯曲菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定， 其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。
[0003] 免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但国内外目前尚 无可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以空肠弯曲菌为检测靶标，所要求保护的技 术涉及空肠弯曲囷快速检测广品。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于检测空肠弯曲菌的PCR反应管。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种用于检测空肠弯曲菌的免疫PCR检测试剂盒。
[0006] 本发明的第一方面是提供了一种用于检测空肠弯曲菌的PCR反应管，所述的PCR 反应管包括：
[0007] 免疫PCR管；和
[0008] 包被于所述的免疫PCR管管体内壁的抗空肠弯曲菌单克隆抗体，所述的抗空肠 弯曲菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457或3G2D8H3G9,CGMCC No. 8766 产生。
[0009] 本发明的第二方面是提供了一种检测试剂盒，所述的试剂盒含有所述的PCR反应 管。
[0010] 在一优选例中，所述的试剂盒还含有容器a，所述的容器a中装有所述的PCR反应 管。
[0011] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、引物、 阳性对照和阴性对照。
[0012] 在另一优选例中，所述的引物包括正向引物和反向引物。
[0013] 在另一优选例中，所述的阳性对照为灭活的空肠弯曲菌菌液，所述的阴性对照为 灭菌的布氏肉汤。
[0014] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明的试剂盒的使用流程和原理图。
[0016] 图2是空肠弯曲菌直接PCR梯度稀释检测限研究结果。
[0017] 其中，M:lOOObpDNAladder;N:阴性对照；1-8号泳道对应的细菌浓度为： 1. 67X10s~1. 67X10cfu/mL。
[0018] 图3是空肠弯曲菌免疫PCR检测试剂盒检测空肠弯曲菌梯度稀释检测限研究结 果。
[0019] 其中，M:lOOObpDNAladder;N:阴性对照；1-8号泳道对应的细菌浓度为： 1. 67X10s~1. 67X10cfu/mL。
[0020] 图4是检测试剂盒特异性的结果。
[0021] 其中，M:1000bpDNAladder;N:阴性对照；1-15号泳道分别为：空肠弯曲菌CICC 22937、ATCC29428、ATCC33291、ATCC33560、CICC6071，金黄色葡萄球菌ATCC27660,鼠 伤寒沙门氏菌ATCC22956,肠炎沙门氏菌ATCC13076,单增李斯特菌ATCC43251，小肠结 肠炎耶尔森氏菌ATCC23715,福氏志贺氏菌ATCC12022,宋内氏志贺氏菌ATCC25931，痢 疾志贺氏菌ATCC51329,乙型溶血性链球菌ATCC10373,阪崎肠杆菌ATCC29004。
[0022] 图5是模拟带菌牛奶样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0023] A(l)模拟带菌牛奶样品直接PCR检测限研究结果；
[0024] A⑵模拟带菌牛奶样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0025] 其中，M:lOOObpDNAladder;N:阴性对照；1号泳道为牛奶样品（不加菌液）；2-8 号泳道对应的细菌浓度为：1. 67X102~1. 67X10scfu/mL。
[0026] 图6是模拟带菌酸奶样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。
[0027] B⑴模拟带猪肉样品直接PCR检测限研究结果；
[0028] B⑵模拟带猪肉样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；
[0029] 其中，M:lOOObpDNAladder;N:阴性对照；1号泳道为酸奶样品（不加菌液）；2-8 号泳道对应的细菌浓度为：1. 67X102~1. 67X10scfu/mL。
【具体实施方式】
[0030] 本发明人的研究表明，以空肠弯曲菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得 到抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9,其抗体效价可达到1:100000,其能够 特异性、高效地与空肠弯曲菌结合，检测灵敏度达到l〇5cfu/ml。与单增李斯特、猪霍乱沙 门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、出血性大肠杆菌0157:H7、阪 崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌等共计91种病原细菌均无交叉反应。
[0031] 在此基础上，本发明人进而将致病菌免疫富集技术和基因水平检测技术有效结 合，即先用本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体将待测样品中的病原菌特异性免疫富集，然 后再进行PCR扩增，从而提供了一种可快速、高效检测食源性空肠弯曲菌的检测试剂盒。
[0032] 抗体
[0033] 本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3(CGMCC No. 8457)或3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766)分泌产生。本发明包括具有抗空肠弯曲菌单克隆 抗体4C9E1G7H3或3G2D8H3G9的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋 白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区（互补决定区， CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物（即免疫偶联物及融合 表达产物），只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳 地至少95%同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒 素、细胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗空肠弯曲菌单克隆抗 体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结 合的细胞表面标记物或抗原。
[0034] 对于本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。 抗空肠弯曲菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区（complementaritydetermining region，⑶R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些 具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗空肠弯曲菌单克隆抗 体⑶R具有90%以上（较佳地95%以上）的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体， 还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或（Fab'）2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0035] 本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以 用常规技术，利用杂交瘤细胞系 4C9E1G7H3(CGMCCNo. 8457)或 3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766) 获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0036] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 [0037] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0038]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子（或如载 体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0039] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这 些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0040] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0041] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为 原核生物如空肠弯曲菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处 理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿 孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机 械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0042] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0043] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析（凝胶过 滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法 的结合。
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