] 本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9,其效价高（可以达 到1:100000)，能够特异性地、高效地检测空肠弯曲菌，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒 沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、出血性大肠杆菌0157:H7、阪崎肠杆菌、 小肠耶尔森氏菌等共计91种病原细菌均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。
[0045] 检测试剂盒
[0046] 本发明人根据免疫PCR的原理，制备了一种可用于检测样品中空肠弯曲菌的试剂 盒，即先用本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3或3G2D8H3G9将待测样品中的病 原菌特异性地免疫富集，然后再进行PCR扩增，以提高检测的灵敏度和特异性。
[0047] 具体而言，本发明首先是提供了一种用于检测空肠弯曲菌的PCR反应管，它包括 免疫PCR管和包被于所述免疫PCR管管体内壁的抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3或 3G2D8H3G9,所述的抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9分别由小鼠杂交瘤细 胞系 4C9E1G7H3,CGMCCNo. 8457 或 3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766 分泌产生。
[0048] 在此基础上，本发明进而提供了一种空肠弯曲菌免疫PCR检测试剂盒，它含有上 述用于检测空肠弯曲菌的PCR反应管；
[0049] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还装载有容器a，所述的容器a可以是自 封袋或者其他形式的容器，其中装有本发明的包被有抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3 或3G2D8H3G9的PCR反应管。
[0050] 此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的本发明的试剂盒中优选地 还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是免疫PCR检测试剂盒中常规使用的一些试 剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如 (但不限于）：缓冲液（10XPCRBuffer)、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20(灭菌双蒸水）、引物等 常规PCR反应试剂。10XPCRBuffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20与常规的免疫PCR检测试 剂盒中的所用的试剂相同。同时，为了消除假阳性和假阴性，还可在PCR检测过程中设置质 控（对照），即在本发明的试剂盒中还包含有阴性对照和阳性对照等。较佳地，所述的阳性 对照溶液为灭活的空肠弯曲菌菌液，阴性对照溶液为灭菌的布氏肉汤（Brucellabroth)。 如本领域技术人员所熟知，上述试剂和溶液可分别装载于EP管或试剂瓶中。
[0051] 此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方 法。
[0052] 本发明的有益效果：本发明的空肠弯曲菌免疫PCR检测试剂盒集病原菌浓缩、特 异性抗体识别以及PCR扩增为一体，具有检测结果准确性高、特异性强、灵敏度高以及检测 快速、使用方便等优点，弥补了现有食源性致病菌检测技术费时耗力、灵敏度低的不足。
[0053] 本发明的空肠弯曲菌免疫PCR检测试剂盒适用于菌株快速鉴定、食品中食源性致 病菌检测等诸多领域，尤其适用于样品中微量病原体的快速检测。可供质监部门、进出口检 疫部门等用于检测食样中的空肠弯曲菌。
[0054] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory PreSS，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0055] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0056] 实施例1.抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的制备
[0057] -、免疫原和阳性标准品的准备
[0058] 空肠弯曲菌（CICC22937)接种在布氏肉汤上，37°C、150r/min振荡厌氧条件 培养17h，计数，加入0. 3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整空肠弯曲菌（CICC No. 22937)浓度至5X109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为10scfu/ml作为阳性 对照标准品，布氏肉汤为阴性对照标准品。
[0059] 二、单克隆抗体的制备
[0060] 1、实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0061] 2、免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一 次。
[0062] 3、采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0063] 4、细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融 合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%C02培养箱培养。
[0064] 5、杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将 其转移至24孔培养板。
[0065] 6、克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔 底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 - 4次，直至阳性率达到 100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2X106个 杂交瘤细胞，7~10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。
[0066] 三、单克隆抗体纯化及鉴定
[0067] 腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用ProteinGSepharose亲和层析法纯化；纯 化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价（见表1);再用SDS-PAGE分析纯度，5% 积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像 分析系统观察结果。
[0068] 表1.两株单克隆抗体效价测定结果（0D45。）
[0069]
[0070] 实施例2.单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的特性鉴定
[0071] -、单克隆抗体亚类鉴定
[0072] 1、抗原包被：用0. 01MPBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50y1，4°C包被过夜， 次日弃去孔内液体，洗板3遍。
[0073] 2、封闭：每孔加入1%BSA200y1，4°C封闭过夜。次日拍干板子不洗板。
[0074] 3、加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50yl。37°C，孵育 lh〇
[0075] 4、洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM， k，A，37°C孵育lh。
[0076]5、洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)， 37°C，孵育 30min。
[0077]6、洗板4遍后，加入100y1底物显色液，37°C，避光显色lOmin。于450nm波长下 读取结果。
[0078] 如表2所不，H3属于IgG2a亚类，G9属于IgGl亚类。
[0079] 表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果
[0080]
[0081] 二、单克隆抗体交叉反应测试
[0082] 1、抗原包被：将96种10scfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌 加3各孔，每孔100y1，4°C，包被过夜。
[0083] 2、封闭：洗板3遍后，每孔加入3%BSA200y1，37°C孵育2h。
[0084] 3、洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100y1，37摄氏度孵育lh。
[0085] 4、洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100y1，37摄氏 度孵育lh。
[0086]5、洗板4遍。加入底物显色液，37°C，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。
[0087]表3.两株单克隆抗体交叉反应检测结果
[0088] CN105132282A 说明书 7/12 页
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 实施例3PCR反应管的制备
[0093] 本发明的用于检测空肠弯曲菌的PCR反应管的具体包被方法如下：
[0094] 1、用包被缓冲液稀释本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3或3G2D8H3G9 至1:300倍，抗体浓度为10yg/mL，将稀释好的单克隆抗体每管50uL加入免疫PCR管中， 4 °C过夜包被；
[0095] 2、包被缓冲液（CarbonateCoatingbuffer(1X))的配方为：无水碳酸钠 Na2C03l. 59g，碳酸氢钠NaHC032. 93g，叠氮化钠NaN30. 2g，溶于1000ml蒸馏水中，调pH至 9. 6,4°C保存。
[0096] 实施例4空肠弯曲菌免疫PCR检测试剂盒的制备
[0097] 制备本发明的空肠弯曲菌免疫PCR检测试剂盒，它含有：
[0098] 实施例3制备的PCR反应管，装入自封袋内；EP管装载的10XPCRBuffer-管、 dNTP-管、TaqDNA聚合酶一管、ddH20 -管、正向引物一管、反向引物一管；试剂瓶装载的阳 性对照一瓶、阴性对照一瓶。
[0099] 10XPCRBuffer装量为 300uL;dNTP的浓度为 2. 5mmol/L，装量为 150uL;TaqDNA 聚合酶浓度为5U/L，装量为60uL;引物设计针对空肠弯曲菌VS1基因，正向引物为gatatg tatgattttatettg，浓度为 10umol/L;装量为 150uL;反向引物为gaatgaaattttaga atgggg，浓度为10umol/L，装