一种缩合鞣质的巯乙胺基取代降解产物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物领域，涉及一种缩合鞣质的巯乙胺基取代降解产物的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 缩合鞣质是由羟基黄烷类化合物以碳-碳键相连而成的缩合物（姚新生.天然 药物化学.北京：人民卫生出版社，1999:247.)，缩合鞣质结构单元的研究通常采用酸催化 降解的方法，在适当的酸性条件下，黄烷-3-醇单元之间的连接键易发生断裂，末端的结构 单元被释放出来的同时，其延伸单元中C环4位形成的碳正离子易被适当的亲核试剂所捕 捉，形成亲核试剂附加产物（Delphine Callemien，Sylvain Guyot，Sonia Ciollin.Use of thiolysis hyphenated to RP-HPLC-ESI(-)-MS/MS for the analysis of flavanoids in fresh lager beers [J]. food chemistry, 2008, 110:1012-1018.)。基于这一化学特性，以 间苯三酚降解法和以苄硫醇为主要亲核试剂的硫醇降解法成为了各种缩合鞣质结构分析 的经典分析手段，并一直应用至今。但是卞硫醇有毒且气味难闻，间苯三酚降解效率低。
[0003] 对于缩合鞣质结构单元的研究，本发明人采用盐酸巯乙胺试剂硫解结合反相HPLC 分析的方法，首先获得缩合鞣质部位的组成结构单元信息，并进一步建立各结构单元的外 标工作曲线，以缩合鞣质部位的降解产物为待测物进行HPLC分析，通过计算获得该缩合鞣 质部位的平均分子量、平均聚合度、没食子酰化率等结构信息。为进行上述的结构研究，需 要缩合鞣质各降解产物的对照品，降解产物中除儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表 儿茶素没食子酸酯等组成缩合鞣质结构单元的羟基黄烷类化合物外，还有各化合物对应的 巯乙胺基取代物。由于各组成缩合鞣质的结构单元的化合物均有商品可以购买，而其对应 的巯乙胺基取代物则没有相应的商品，因此需自行制备。
[0004]根据文献报道（J.L.TorresandR.Bobet,NewFlavanolDerivativesfrom Grape(Vitisvinifera)Byproducts.AntioxidantAminoethylthi〇-Flavan-3-〇l ConjugatesfromaPolymericWasteFractionUsedasaSourceofFlavanols,J. Agric.FoodChem. 2001，49, 4627-4634)，以往有研究者采用阳离子交换的方法分离羟基黄 烷类化合物巯乙胺基取代物，利用羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物带电荷的性质将其与 其他物质分离，然后再用反相半制备高效液相色谱进一步纯化，但是这种方法不仅操作复 杂，而且需要使用大量无机盐，给化合物的纯化造成了很大困难，耗时长且得率较低，严重 阻碍了研究工作的进展。
[0005]目前亟需新的制备羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物且操作相对简便的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种羟基黄烷类化合物巯乙胺 基取代物的分离或制备方法。本发明人惊奇地发现，本发明的方法制备羟基黄烷类化合物 巯乙胺基取代物，步骤少、操作简便。由此提供了下述发明：
[0007] 本发明的一个方面涉及一种分离羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物的方法，包括 下述步骤：
[0008] (1)将样品进行C18常压柱色谱分离，所述C18常压柱色谱分离为一次或者多次 (例如2、3、4或5次）。
[0009] 所述样品可以是液体样品，也可以是固体例如粉末状样品，通过适当的溶剂例如 甲醇等进行溶解。
[0010] 根据本发明任一项所述的方法，其中，所述样品含有羟基黄烷类化合物巯乙胺基 取代物；
[0011] 优选地，所述样品为或者含有如下的a或b :
[0012] a.缩合鞣质经过硫解试剂进行降解的产物；或者
[0013] b.含有缩合鞣质的植物提取物（例如含有缩合鞣质的葡萄籽提取物或者含有缩 合鞣质的金荞麦的提取物如威麦宁）经过硫解试剂进行降解的产物；
[0014] 优选地，上述a或b中所述的硫解试剂为盐酸巯乙胺。
[0015] 在本发明一个优选的实施方案中，上面所述的降解在水浴条件下进行；优选地， 在 50°C -80°C水浴温度下进行，更优选为 60°C -70°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、 66°C、67 °C、68°C、69 °C、70°C，或者任意两个上述的具体温度数值所构成的温度范围；和/ 或优选地，水浴的时间为 5_50min，更优选为 10_30min、10_25min、10_20min、lOmin、llmin、 12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，或者任意两个上述的具体 时间数值所构成的时间范围。在本发明一个特别优选的实施方案中，在65°C下水浴15min。 优选的水浴温度和/或时间有利于充分降解，也有利于羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物 的得率的提高。
[0016] 现有技术使用的降解试剂卞硫醇有毒且气味难闻，间苯三酚降解效率低，本发明 中采用无味、无毒的盐酸巯乙胺代替卞硫醇和间苯三酚作为亲核试剂降解缩合鞣质。盐酸 巯乙胺的结构式为：H 2N-H2C-H2C-SH. Hcl。
[0017] 所述含有缩合鞣质的葡萄籽提取物可以采用现有技术中的方法制备。优选地，采 用50-95%乙醇提取，再经过大孔吸附树脂纯化。
[0018] 所述含有缩合鞣质的金荞麦提取物可以采用50-95%乙醇提取，再经过大孔吸附 树脂纯化。威麦宁是植物金荞麦的乙醇提取物，主要成分是缩合鞣质，采用95%乙醇提取， 再经过大孔吸附树脂纯化。
[0019] 根据本发明任一项所述的方法，其中，a或b中所述的缩合鞣质如下面的式A所示 (其中箭头表示下一个结构单元在这个位点连接），
[0020]
[0021] 其中，
[0022] 札选自H和OH ;
[0023] R2选自OH和下面的式II，
[0024]
[0025] 根据本发明任一项所述的方法，其中，所述羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物如 下面的式I所示，
[0026]
[0027] 其中，
[0028] 札选自H和OH;
[0029] R2选自H、0H和式II;
[0030] R3选自H、0H和式II;
[0031] 并且私和R3不相同；
[0032]
[0033] 根据本发明任一项所述的方法，其中，
[0034] 所述羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物如下面的化合物：
[0035] 表1 :本发明涉及的部分具体羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物
[0036]
[0037]
[0038]
[0039] 在本发明中，上面的化合物1又简称为1号峰化合物，化合物2又简称为2号峰化 合物，化合物3又简称为3号峰化合物。
[0040] 根据本发明任一项所述的方法，其中，步骤（1)中所述的C18常压柱色谱分离满足 如下的1)至4)项中的任意一项、两项、三项或者四项：
[0041] 1)流动相为甲醇水溶液，浓度为2%-12%，优选地，浓度为3%-12%、4%-12%、 5% -12%、2% -10%、4% -11%、2%、3%、4%、4. 5%、5%、5. 5%、6%、6. 5%、7%、7. 5%、 8%、8. 5%、9%、9. 5%、10%、10. 5%、11%、11. 5%或12%，或者上述任意两个数值构成的 数值范围；
[0042] 2)所述流动相还含有甲酸或乙酸，其浓度为0.01 % -1% ;优选地，其浓度为 0? 05 % -0? 5 %、0? 1 % -0? 5 %、0? 1 % -0? 4 %、0? 1 % -0? 3 %、0? 15 % -0? 25 %、0? 01 %、 0? 05%、0. 1%、0. 15%、0. 2%、0. 25%、0. 3%、0. 35%、0. 4%、0. 45%、0. 5%或 1%，或者上 述任意两个数值构成的数值范围；
[0043] 3)每个流份的体积为 l_15mL ;优选地，为 2-10mL、3-8mL、4-6mL、2、3mL、4mL、5mL、 6mL、7mL、8mL、9mL或10mL，或者上述任意两个具体体积数值构成的体积范围；
[0044] 4)采用湿法装柱，湿法上样；装柱后用甲醇冲洗至无杂质（例如通过HPLC检测）， 再将流动相逐步过渡至起始比例；优选地，装柱体积为10-1000mL、50-1000mL、50-500mL、 100-500mL、200-500mL、200mL、250mL、300mL、400mL、500mL，或者上述任意两个具体体积数 值构成的体积范围。
[0045] 根据本发明任一项所述的方法，其中，步骤（1)中，通过HPLC检测洗脱流份，将纯 度相同或相近的部分合并，除去甲醇；优选地，还对除去甲醇后的产物进行冷冻干燥。
[0046] 除去甲醇可以使用本领域技术人员知悉的方法，例如减压浓缩。本领域技术人员 亦知晓，在此过程中，甲酸或者乙酸也除去了。
[0047] 根据本发明任一项所述的方法，其中HPLC的条件如下：
[0048]色谱柱：Thermo Syoronis C18 色谱柱（4. 6mmX 250mm，5 y m);柱温：30°C ;流速： lmL/min ;进样量：20 y L ;检测波长：280nm ;
[0049] 流动相：以0.2%甲酸水（A)和0.2%甲酸乙腈（B)为流动相梯度洗脱，洗脱程序 如下面的表2，
[0050] 表2 :梯度洗脱程序
[0051]
[0052] 〇
[0053] 在本发明的一个优选的实施方