一种精确定量检测转基因玉米品系t25的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种定量检测转基因玉米品系T25的试剂盒及检测方法，属分子生物 学领域。
【背景技术】
[0002] 随着转基因作物在全世界范围内的广泛种植，其食用安全和环境安全问题一直受 到广大消费者、各国政府及相关国际组织的高度重视。很多国家和地区纷纷制订了转基因 生物安全管理法规，实施标识制度。我国农业部于2002年1月5日，发布了《农业转基因生 物标识管理办法》，规定在中国境内销售列入目录的农业转基因生物，应当有明显的标识。 今年10月份实施的新《食品安全法》又进一步对转基因食品作出了必须"显著标示"的明 确规定，运必然会对转基因成分的检测提出更高的需求。然而不同于欧盟（标识阔值0.9)、 澳大利亚（标识阔值1. 0)、韩国（标识阔值3. 0)、日本（标识阔值5. 0)等国家，我国尚未 出台转基因标识阔值法规，采取定性标识即零阔值，运与我国现行的转基因检测主要是W 定性方法为主，缺乏可W定量的标准方法不无关系。因此，研究建立转基因精准定量检测方 法，可为我国转基因产品定量标识和阔值管理奠定基础，推动与国际接轨，并为维护国际贸 易中的国家利益提供技术保障。
[0003] 食品中转基因成分的含量通常是W转入基因与内源基因的数量之比来表示的， 实时巧光PCR(qPCR)是现今国际上通用的定量检测方法。该方法利用巧光信号的变化实 时检测PCR扩增反应中扩增产物量的变化，通过对梯度稀释的有证标准物质（Certified ReferenceMaterials,CRM)的检测，分别获得内源和外源基因标准曲线，进而通过循环阔 值（Ct)计算得到待测样品中内源和外源基因的含量。可见，样品中核酸扩增的抑制成分、 实验环境和操作者的技能等都会直接影响扩增效率和标准曲线的质量，从而干扰定量的准 确性。
[0004] 近年来新兴起的微滴式数字PCR技术（化opletdigitalPCR，ddPCR)，通过把稀释 到一定浓度的DM分子分布到10000~20000个微滴中，使大部分微滴中DM分子的数量 为1或0,然后通过PCR扩增和阳性信号的累积来读取阳性反应单元数，再根据泊松分布计 算出样本中的DNA分子拷贝数。当前，利用ddPCR进行转基因定量检测尚处于起步阶段，研 究报道数量不多，主要是针对MonSlO转基因玉米，对其余转基因品系定量检测的有效性和 实用性尚未可知，开发空间和应用前景广阔。
[0005] 转基因玉米是全球种植面积最广的转基因作物之一，选取其中具有代表性的品系 T25为研究对象，分析其基因构成，选择合适的内外源基因组合，设计出高度特异的引物和 探针，建立适用于T25转基因定量的双重ddPCR检测方法。经特异性、检测动态范围、L0D、 L0Q、准确性和重复性验证，证明该方法满足了国际上对转基因定量检测的技术要求，从而 为其他转基因作物的精准定量研究奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一组用于检测转基因玉米品系T25的引物和探 针。
[0007] 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种精确定量检测转基因玉米品系T25 的试剂盒。
[0008] 本发明要解决的第Ξ个技术问题是提供一种精确定量检测转基因玉米品系T25 的检测方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0010] 本发明提供了一组用于检测转基因玉米品系T25的引物和探针，是由用于扩增外 源基因pat-T35S的引物和探针，W及用于扩增内源基因zein的引物和探针组成，序列见表 1。其中，扩增外源基因pat-T35S的探针5'端标记肥X，3'端标记B册，扩增内源基因zein 的探针5'端标记FAM，3'端标记B册。
[00川表1ddPCR引物/探针序列
[0012]
[0013] 本发明还提供一种精确定量检测转基因玉米品系T25的试剂盒，该试剂盒包括上 述用于检测转基因玉米品系T25的引物和探针。进一步地，该试剂盒还包括完成双重数字 PCR反应所需材料和试剂，例如阳性对照、ddPCRmastermix、醋酸儀、微滴生成油、微滴生 成卡、96孔板和侣锥热封膜等，上述材料和试剂优选为单独包装。
[0014] 本发明还提供了一种精确定量检测转基因玉米品系T25的检测方法，特别是一种 利用双重数字PCR技术精确定量检测转基因玉米品系T25的方法，该方法包括：
[0015] (1)提取待测样品DNA，可W使用现有技术中已知的提取方法或商业化试剂盒进 行提取；
[0016] (2)配制双重ddPCR反应体系，其中，所述反应体系包括序列表中SEQIDNO:1至 SEQIDN0:3所示的用于扩增外源基因pat-T35S的引物和探针，化及序列表中SEQIDNO: 4至SEQIDNO:6所示的用于扩增内源基因zein的引物和探针；优选地，在本发明的一个 具体实施方案中，双重ddPCR反应体系如表2所示；
[0017] 表2玉米转基因品系T25双重ddPCR反应体系
[0018]
[0019] ?将步骤似配制的双重(1(1。0?反运体系和微滴生1^油加入微滴生]^^卡中，置于 微滴生成仪中生成微滴；
[0020] (4)将生成的油包水的微滴转移至96孔板中，进行扩增反应，反应条件见表3 ;
[0021] 表3玉米转基因品系T25ddPCR反应条件
[0022]
[0023] 注：升降溫速度应《2. 5°C/s
[0024] 妨结果判定。
[0025] 将扩增后的96孔板置于微滴读取仪（QX100,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用 如antaSoft软件进行结果读取和分析。微滴读取仪中两个信号通道分别读取内源基因 zein的FAM和外源基因pat-T35S的肥X巧光信号，含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产 物的阴性微滴会呈现出巧光信号强度的差异，可W阴性微滴簇巧光幅度的最高点为界来设 定阔值线。按照泊松分布原理计算获得玉米内、外源基因的拷贝数，进而通过如下公式计算 获得转基因玉米T25的百分含量。
[0026]
[0027] 本发明的优点是：1)对核酸分子的绝对定量避免了由PCR扩增效率差异所导致的 偏差；2)无需依赖有证标准物质或其他标准品；3)具有更高的精确度、灵敏性和重复性，易 于标准化；4)更适合低拷贝数的核酸检测，适用于低丰度转基因成分的精准定量；5)由于 ddPCR是终点检测，对抑制剂的耐受度更高，因此可降低由基质类型所导致的检测偏差。6) 通过不同的巧光信号标记，更易实现在同一反应体系中内外源基因的双重扩增反应，从而 降低检测成本。
[0028] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开 内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【附图说明】
[0029] 图1不同退火溫度条件下zein(A)和pat-T35S度）的ddPCR检测结果。
[0030] 图2双重ddPCR对内源基因zein(A)和外源基因pat-T35S做的检测动态范围。
[0031] 图3不同浓度A0CS0306-册中％T25含量的ddPCR测定。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1 ddPCR引物、探针设计
[0033] 为实现对转基因玉米品系T25和玉米基因组的特异性检测和绝对定量分析，我们 分别选取插入pat基因3'端同CaMV35S终止子的连接区域（Genebankno.DQ156557. 1)W 及玉米单拷贝内源基因zein的3'端（GenBankno.JQ083080. 1)作为祀序列，通过NCBI在 线工具进行序列分析和比对，利用PrimeExpress软件￥3.0(481,化31日1·City,CA,USA)设 计出50余对引物和探针组合，经过筛选最终获得特异性强、适用于ddPCR扩增条件的内外 源引物/探针组合各1套，序列见表1。外源基因pat-T35S探针5'端标记肥X，内源基因 zein探针5'端标记FAM，两个探针的3'端均标记B册，从而可在同一ddPCR反应体系中完 成对内外源基因的同步扩增检测，为玉米基因组中转基因玉米品系T25含量的相对定量分 析奠定基础。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0034] 实施例2试剂盒组成
[0035] 该试剂盒包括实施例1设计的用于检测转基因玉米品系T25的引物和探针，阳性 对照（T25转基因玉米叶片基因组DNA，为有证标准物质，购自美国油类化学家学会），ddPCR mastermix(购自美国BioRad公司）、微滴生成油（购自美国BioRad公司）、25mM醋酸儀 (购自美国Sigma公司）、微滴生成卡（购自美国BioRad公司）、TwinTecSemi-Skirted 96孔板（购自德国化pendo计公司）、侣锥热封膜（购自美国BioRad公司）。
[0036] 实施例3检测方法的建立
[0037] 1.DNA提取
[003引采用改良的CTAB法提取样品中的DNA。具体步骤如下：取lOOmg样品，加入 300μL灭菌去离子水，充分均质混匀；加入700μL预热到65°C的CTAB缓冲液，混匀后加 入10μLRNase溶液，振荡；65°C加热30min;热入10μL蛋白酶K溶液，轻轻混匀，65°C加 热30min;12000g离屯、lOmin，将上清转移到一个含有500μΙ氯仿的1.5血离屯、管中，振荡 80s;12000g离屯、15min，直至出现明显的分层；将上层液相转移到一个含有500μL氯仿的 1. 5mL离屯、管中，振荡；12000g离屯、5min，将上层液相转移到一个新的1. 5mL离屯、管中；加 入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，吹打混匀；室溫下放置60min;12000g离屯、5min，弃去上清； 加入350μL氯化钢（1. 2M)溶解沉淀；加入350μL氯仿后振荡30s;12000g离屯、lOmin， 将上层液相转移至一个新的离屯、管中；加入0. 6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后，室溫放置 20min;12000g离屯、lOmin，弃去上清；加入70%乙醇500μL，混匀；12000g离屯、10min，弃去 上清；干燥沉淀后，用100μL灭菌TE重溶DNA。对提取的核酸用核酸蛋白分析仪（Beckman Coulter,DU800)进行浓度和纯度的测定，确保提取核酸的A260/A280在1. 8-2. 0之间，浓度 应> 10化g/μL于-20°C保存备用。
[0039] 2.按照表2配制20μL的ddPCR反应体系
[0040] 3.微滴生成
[0041] 将20μL的ddPCR反应体系和70μL微滴生成油分别加入到8孔微滴生成卡中， 置于微滴生成仪（QX100,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中生成微滴。
[004引 4.扩增反应
[0043] 将生成的油包水的微滴（40μL)缓慢转移至lippendorfTwinTecSemi-Ski;rted 96孔板中，封膜后置于PCR仪（GeneAmp9700,Applied8;[0573161113,化3161·City,CA)上进 行扩增反应，扩增条件如表3所示。
[0044] 5.结果判定
[0045] 将扩增后的96孔板置于微滴读取仪（QX100,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用 如a