ntaSoft软件进行结果读取和分析。微滴读取仪中两个信号通道分别读取内源基因 zein的FAM和外源基因pat-T35S的肥X巧光信号，含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产 物的阴性微滴会呈现出巧光信号强度的差异，可W阴性微滴簇巧光幅度的最高点为界来设 定阔值线。按照泊松分布原理计算获得玉米内、外源基因的拷贝数，进而通过如下公式计算 获得转基因玉米T25的百分含量。
[0046]
[0047] 本发明还对ddPCR检测条件进行了优化，例如退火溫度。取样品S2、S3作为模板， 分别在50°C、53°C和55°C的退火溫度下进行扩增反应，比较不同条件下ddPCR的检测结果。 由图1可见，50°C条件下内源基因zein的扩增效率偏低，阳性微滴和阴性微滴分界不明显； 53°C和55°C条件下zein和pat-T35S的扩增效率较高，可出现比较明显的阳性微滴簇，且 53°C条件下扩增的巧光信号略高于55°C，因此，将53°C作为最佳最火溫度。
[0048] 本发明还对单/双重反应效果进行了比较。分别配制zein、pat-T35S、zein/ pat-T35SΞ种反应体系，每种体系设8个检测复孔，其中一孔用作阴性对照，其余7个复孔 则均含有样品U6的DNA模板75ng(预计zein基因27523拷贝，pat-T35S基因430拷贝， T25含量1. 56% )，进行ddPCR检测。结果发现单重与双重ddPCR检测到的zein拷贝数（偏 差=1. 1% )、pat-T35S拷贝数（偏差=4. 3% )和T25百分含量（偏差=2.8% )均没有 显著差异（表4)，且双重反应的测定值变异系数较单重反应偏小（表4)，说明具有更好的 重复性。
[0049] 表4单重和双重ddPCR的定值效果比较
[0050]
[0051] 实施例4检测方法特异性评价
[0052] 标准品/参照样品
[0053]T25玉米叶片基因组DNA(A0CS0306-册，120ng/yL)等有证标准物质（certified referencematerials,CRM)均购自美国油类化学家学会（A0C巧或欧盟执委会联合研究中 屯、标准与测量研究院（IRMM)，其他转基因阳性样品如华番一号番茄由广东出入境检验检 疫局（GDCI曲提供，转基因水稻BT63、科丰6号和克惧稻来自中国检验检疫科学研究院组 织的协同验证试验（CAIQ-CT)，另外非转基因棉花巧和小麦粉则为北京出入境检验检疫局 度JCI曲保存样品，详细信息见表5。
[0054] 表5实验用样品列表
[00巧]
[0057] 采用表5中所列样品包括其他品系的转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、 转基因水稻、转基因番茄、转基因马铃馨、非转基因棉花和小麦粉等，取其DNA，调节浓度至 7化g/μL分别用于ddPCR检测，每个样品设2个平行重复，同时W无菌水代替模板作为阴 性对照，WA0CS0306-册化化g/μ?作为阳性对照，判定该方法的特异性。结果发现A0CS 0306-册和其他品系的转基因玉米、非转基因玉米的zein基因均出现阳性扩增信号，但运 些玉米样品中只有AOCS0306-册的pat-T35S基因检测呈阳性；另外，其他非玉米样品的 zein和pat-T35S基因检测均呈阴性，无阳性微滴（结果未显示）。证明该方法具有良好的 特异性。
[0058] 实施例5检测动态范围、最低检测限、最低定量限
[0059] 玉米叶片基因组DNA(A0CS0306-册）为120ng/μL1拷贝玉米基因组为2. 725pg (Arumuganathan&Earle, 1991)，因此AOCS0306-册中玉米内源基因zein和外源基因 pat-T35S的含量为44037拷贝/μL。将A0CS0306-册用TE缓冲液按一定比例进行稀释， 得到系列不同浓度的标准品S1-S6 (表6)，各稀释样品分别进行双重ddPCR检测，每个样品 设5个重复，同时设置1个空白对照（W去离子水代替模板DNA)。
[0060] 表6标准样品的稀释与配制列表
[0061]
[0063]结果发现在20μΙ双重ddPCR反应体系中，zein和pat-T35S基因含量分别在 8. 8~29904和8. 6~26376拷贝数范围内均呈现出非常好的线性关系，其相关系数R2分别 达0. 9999和1 (图2)。其检测动态范围超过4个数量级，覆盖转基因常规实验室检测（通 常外源基因同内源基因拷贝数比值在0. 1% -100%范围内）所需要的祀基因浓度范围。
[0064] 最低检测限化0曲是指在可接受的精度和准确性水平上，待测模板能被可靠定值 的最低拷贝数水平。具体是指在检测动态范围内，测得拷贝数的变异系数CV《25%的最低 检测水平。根据运一标准，玉米内源基因zein和外源基因pat-T35S的双重ddPCRL0Q分 别为23和25拷贝（表7和表8)。
[0065] 最低检测限化0D)是指一个样品中能被可靠检测到，而不一定定值的最低拷贝 数。通常将5个重复的阳性微滴数均大于或等于2时，所对应的最低浓度定为L0D。因此， 在本研究中zein和pat-T35S的L0D分别为8. 8和8. 6拷贝（表7和表8)。
[0066] 表7ddPCR检测动态范围、L0D和L0Q分析结果I。
[0067]
[006引注：加*号为LOD值，加#号为LOQ值，对每个稀释液均进行5个重复测试（包括NTC)。
[0069] 表8 ddPCR检测动态范围、LOD和LOQ分析结果II。
[0070]
[0071]注：加*号为LOD值，加#号为LOQ值，对每个稀释液均进行5个重复测试（包括 NTC)。
[00刮实施例6准确性
[0073] 准确性（truness)是指一组测试结果的平均值与可接受的参考值之间的一致性 程度。按照欧盟与Codex的标准，准确度的判定标准是在整个检测动态范围内，测定值应在 参考值±25%范围内。
[0074] 利用A0CS 0306-册(GM0含量>99. 99% )和非转基因玉米叶片DNA标准品A0CS 0306-C2(GM0含量<0. 01%)按一定比例混合，配制一系列核酸浓度均为75ng/yL不同 T25百分含量的转基因样品U1-U8(表6)，各样品分别进行双重ddPCR检测，每个样品设7 个重复，同时设置1个空白对照（W去离子水代替模板DNA)。
[00巧]结果发现在0. 11% -50%的T25含量范围内，玉米内源基因zein拷贝数、外源基 因pat-T35S拷贝数及T25百分含量的ddPCR测定值均同预计值非常接近，其标准偏差基本 都< 10% (表9和表10)，远小于25%的判定标准，说明该方法具有非常好的准确性，且对 该玉米品系的最低定量浓度可达0. 11 %，满足国际上对GM0的定量检测需求。
[0076] 此外，在对梯度稀释的A0CS0306-册进行ddPCR检测的结果同样显示，在整个检 测动态范围内，不同浓度模板所测得的T25的百分含量都在标准参照值（近似于100% )的 ±25%范围内（图3)，符合国际上对定量检测方法的准确性判定标准。
[0077] 表9不同％T25含量转基因玉米的ddPCR检测结果I
[0078]
[0080] 表10不同％T25含量转基因玉米的ddPCR检测结果II
[0081]
[00的]实施例7重复性
[0083] 上述分析动态范围、L0Q和L0D的实验数据和不同％T25含量样品U1-U8的检测 结果皆可用来评估整体检测的重复性。由表7至表10可见，在整个定量检测动态范围内， 针对玉米内源基因zein拷贝数、外源基因pat-T35S拷贝数及T25百分含量的测定变异系 数CV均小于25%，满足国际上对转基因测定方法的验证要求，证明该方法用于T25转基因 玉米定量检测时具有良好的重复性。
[0084] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 W做出其它不同形式的变化或变动。运里无法对所有的实施方式予W穷举。凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 一组用于检测转基因玉米品系T25的引物和探针，其特征在于：是由用于扩增外源 基因pat-T35S的引物和探针，以及用于扩增内源基因zein的引物和探针组成，其中，序列 表SEQIDNo. 1至序列表SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列为用于扩增外源基因pat-T35S 的引物，序列表SEQIDNo. 3所示的核苷酸序列为用于扩增外源基因pat-T35S的探针；序 列表SEQIDNo. 4至序列表SEQIDNo. 5所示的核苷酸序列为用于扩增内源基因zein的 引物，序列表SEQIDNo. 6所示的核苷酸序列为用于扩增内源基因zein的探针。2. 根据权利要求1所述一组用于检测转基因玉米品系T25的引物和探针，其特征在于： 序列表SEQIDNo. 3所示的用于扩增外源基因pat-T35S的探针5'端标记HEX，3'端标记 BHQ;序列表SEQIDNo. 6所示的用于扩增内源基因zein的探针5'端标记FAM，3'端标记 BHQ〇3. -种精确定量检测转基因玉米品系T25的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权 利要求1或2所述的一组用于检测转基因玉米品系T25的引物和探针。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、ddPCR mastermix、醋酸镁、微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和错箱热封膜。5. -种精确定量检测转基因玉米品系T25的检测方法，其特征在于，该方法包括： (1) 提取待测样品DNA; (2) 配制双重ddPCR反应体系，其中，所述反应体系包括序列表中SEQIDNO:1至SEQ IDNO:3所示的用于扩增外源基因pat-T35S的引物和探针，以及序列表中SEQIDNO:4至 SEQIDNO:6所示的用于扩增内源基因zein的引物和探针； (3) 将步骤⑵配制的双重ddPCR反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴 生成仪中生成微滴； (4) 将步骤（3)生成的微滴转移至96孔板中，进行扩增反应； (5) 结果判定。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤（5)中，按照泊松分布原理计算 获得玉米内、外源基因的拷贝数，进而通过如下公式计算获得转基因玉米T25的百分含量：
【专利摘要】本发明公开了一种精确定量检测转基因玉米品系T25的试剂盒及检测方法。具体地，本发明涉及一组用于检测转基因玉米品系T25的引物和探针，其具有序列表SEQ？ID？No.1至SEQ？ID？No.6所示的核苷酸序列，及含有这些引物和探针的试剂盒。本发明还提供了一种利用双重微滴式数字PCR技术精确定量检测转基因玉米品系T25的检测方法，该方法无需依赖有证标准物质或其他标准品，具有更高的精确度、灵敏性和重复性，易于标准化。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105255874
【申请号】CN201510755454
【发明人】魏海燕, 张锡全, 汪万春, 曾静, 徐蕾蕊, 马丹, 魏咏新
【申请人】北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月9日