一种编码缺刻缘绿藻δ9脂肪酸去饱和酶的dna序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体地说，涉及一种编码缺刻缘绿 藻A9脂肪酸去饱和酶的DNA序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 生物体中存在着大量的多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid，PUFA)， 这些PUFA对于维持生物体正常的生理功能具有重要作用，根据从甲基端第一个双键开始 的位置可以将PUFA分为ω-3系和ω-6系。在ω-6系PUFA中，花生四烯酸（arachidonic acid，C20:4A5's'n'14,AA)是最具代表性的脂肪酸之一。AA属人体必需脂肪酸，是机体中具 有重要生理作用的20碳多烯衍生物的前体，如前列腺素E2、前列环素和白三烯等。AA还是 一种重要的营养食品，在大脑和视力发育方面具有特殊作用，因此被广泛添加到婴幼儿食 品配方中。此外，AA还是一种高档化妆品原料，将其添加到一些美容护肤用品及美发用品 中，可以起到保持皮肤湿润、延缓皮肤衰老及预防和治疗脱发的功效。
[0003] AA的传统来源是海洋鱼油和动物脏器。但动物组织中AA含量很低，约为0. 2%和 0. 5%，用这种方法制备的AA价格昂贵，难以满足市场的需要。近年来国外开始以微生物为 原料生产AA，例如，高山被孢霉（Mortierallaalpina)的一个商业性菌株1S-4已被用于工 业化发酵生产AA。而缺刻缘绿藻（MyrmeciaincisaReisigl)的发现，为利用光生物反应 器大规模工业化生产AA提供了新的思路。
[0004] 缺刻缘绿藻是单细胞绿藻，属于绿藻门、Trebouxiophyceae纲，细胞常聚集在一起 形成类似非定形群体的细胞团。研究发现该藻含有大量的AA，尤其在氮饥饿条件下，其含量 能达到藻体总脂肪酸含量的60%。
[0005] 在缺刻缘绿藻等微藻中，AA的合成往往是从饱和脂肪酸开始，即由硬脂酸向油酸 转化，该步骤是由A9FAD催化，在硬脂酸的C9和C10之间引入第一个不饱和的双键，生成 油酸。之后，油酸沿着ω-6途径，再在Δ12、Δ6及Δ5等一系列FAD以及Δ6脂肪酸延长 酶的作用下，最终合成AA。由此可见，由A9FAD将硬脂酸去饱和生成油酸是AA合成的关键 一步。
[0006] 克隆和鉴定获得缺刻缘绿藻A9FAD编码基因对于在植物体中进行遗传操作，以 实现PUFA的高效合成具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供一种分离的核苷酸序列。
[0009] 本发明的另一的目的是，提供一种重组表达载体。
[0010] 本发明的第四个目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。
[0011] 本发明的第五个目的是，提供如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述 的重组表达载体、或如上所述的宿主细胞的用途。
[0012] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] -种多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDN0. 15的第62-432位或SEQID NO. 15所示。
[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0015] -种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列包括：
[0016] a)SEQIDN0. 3 的第 341bp至第 1453bp、SEQIDN0. 3 的第 158bp至第 1453bp、 SEQIDNO. 3或SEQIDNO. 12所示的核苷酸序列；或
[0017] b)与a)所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0018] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0019] -种重组表达载体，所述的重组表达载体是由如上所述的核苷酸序列与质粒或病 毒所构建的重组表达载体。
[0020] 作为本发明的一种【具体实施方式】，所述的质粒是pYES2质粒。
[0021] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0022] -种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种：
[0023] a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；
[0024] b)用如上所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。
[0025] 作为本发明的一种【具体实施方式】，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细 胞或动物细胞。
[0026] 作为本发明的一种【具体实施方式】，所述的宿主细胞是酵母细胞。
[0027] 为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
[0028] 如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体、或如上所述 的宿主细胞在合成多不饱和脂肪酸中的用途。
[0029] 如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体、或如上所述 的宿主细胞在将棕榈酸去饱和为棕榈油酸或将硬脂酸去饱和为油酸中的用途。
[0030] 本发明优点在于：
[0031] 本发明通过对缺刻缘绿藻转录组高通量数据库的筛选，获得1条与已知物种 Δ9FAD基因同源的contig序列（Contigl6329)，并由此设计引物，利用cDNA末端快速扩增 技术（RACE)克隆获得缺刻缘绿藻A9FAD基因的全长序列。在油酸合成缺陷型olel突变株 的酿酒酵母中异源表达该基因去叶绿体转运肽的0RF，对转基因酵母的脂肪酸进行GC-MS 分析，在该转基因突变株酵母中检测到新产生的物质一一棕榈油酸和油酸，从而证明该基 因所编码的蛋白具有A9FAD的功能，且去饱和效率高。本发明为在植物体中进行遗传操 作，以实现PUFA的高效合成创造了条件。
【附图说明】
[0032] 图1.Δ9FAD基因cDNA与DNA序列扩增产物电泳图（A)及其基因结构（B)。泳道 M:DL2000分子量标准；泳道1 :5 ^ -RACE末端产物；泳道2 :3 ^ -RACE末端产物；泳道3 到6 :分别是利用引物对Seq4和Seq5、Seq6和Seq7、Seq8和Seq9及Seq10和Seq 11进行基因DNA序列的扩增产物。灰线和黑线分别为UTR及内含子，黑框为外显子。
[0033]图2. pMD19_T载体图谱。
[0034] 图3. pYES2载体图谱。
[0035] 图4.酵母脂肪酸成分的气相色谱和GC-MS图谱。A:气相色谱图；B、C:分别为图 A-c中自左至右出现两个新物质峰的MS图谱。a:〇lel突变型对照组；b:转空载体对照组； c:转缺刻缘绿藻Δ9FAD基因的酵母Υ-Δ9FAD。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0037] 实施例1
[0038] 本发明所采用的主要操作包括：
[0039] 1)缺刻缘绿藻在温度为25°C、光照强度为115μπι〇1m^1的条件下，于BG-11培 养基中培养，光周期为光照14h:黑暗10h，每天不定期地摇晃。收集藻细胞，提取RNA和 DNA〇
[0040] 2)通过对缺刻缘绿藻转录组高通量数据库的筛选，获得1条contig序列 (Contigl6329)，根据这条序列设计基因特异引物Seq1和Seq2,利用Clontech公司RACE 技术，分别进行5'-端和3'-端片段扩增。回收这两片段并克隆到pMD19-T上，然后转化 至大肠杆菌，经蓝白斑筛选与测序后，与原contig序列拼接并经过重新设计引物进行PCR 反应与测序验证，得到A9FAD基因cDNA的全长序列（Seq3)。
[0041] 3)对获得的Δ9FAD基因cDNA全长序列（Seq3)进行生物信息学分析，发现其开 放阅读框（0RF)为1299bp，根据cDNA全长序列设计四对基因特异引物Seq4和Seq5、Seq 6和Seq7、Seq8和Seq9及Seq10和Seq11，扩增内含子。回收PCR产物，按上述方法 进行测序验证并与原序列拼接，得到A9FAD基因的DNA序列（Seq12)。
[0042] 4)通过生物信息学分析可知，Δ 9FAD基因0RF所编码蛋白序列在其氨基端存在1 个由61个氨基酸组成的叶绿体转运肽。