根据pYES2载体和△9FAD基因不含叶绿体转运肽 的0RF序列设计引物Seq13和Seq14 (含EcoRI/Xbal酶切位点）进行PCR扩增，TA克隆 并经EcoRI/Xbal双酶切后，利用T4连接酶连接得到重组载体ρΥ- Δ 9FAD。
[0043] 5)将重组载体ρΥ-Δ9FAD在电穿孔仪中用电击法转化酿酒酵母油酸合成缺陷型 olel突变株BY4389(His-、Leu_及Ura-缺陷型，便于转基因酵母筛选），运用含0. 005%亚 油酸（LA)的尿嘧啶缺陷合成培养基（SC-U)筛选得到转基因酵母Y-A9FAD。
[0044] 6)将转基因及转空载质粒的酵母接种于YH)培养基，添加适量LA，在2%葡萄糖 YH)培养基中28°C培养3d，达到一定生物量后转到不含LA的YH)培养基中，添加2%的半 乳糖25°C条件下低转速诱导3d。收集酵母，冷冻干燥。直接对酵母利用甲醇-硫酸方法进 行脂肪酸甲酯化。
[0045] 7)利用气质联用（GC-MS)在转缺刻缘绿藻A9FAD基因的酵母细胞中检测到棕榈 酸和硬脂酸的去饱和产物一一分别为棕榈油酸和油酸，说明〇lel突变的酵母BY4389在转 入该基因后，恢复棕榈油酸和油酸的合成能力。从而证明该基因所编码蛋白具有A9FAD的 功能。
[0046] 具体操作如下：
[0047] 1、材料
[0048] 1)缺刻缘绿藻（MyrmeciaincisaReisigl)H4301 购自Culturecollectionof algaeofCharlesUniversityofPrague(CAUP)。在温度为 25°C、光照强度为 115ymol photonsm2s\光/暗比为14h/10h的条件下培养，培养基为BG-11。
[0049] 2)pYES2本实验室保存，油酸合成缺陷型olel突变株酵母BY4389(His_、Leu-及 Ura_缺陷型）购自日本大阪大学。酵母在YH)培养基，于28°C下以200转/min(rpm)转速 振荡培养。
[0050] 2、方法
[0051] 1)取100mg新鲜的藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。
[0052] 2)TRIzol(Invitrogen公司）法抽提总RNA，_2〇°C保存备用。取1_5 μgRNA用反 转录试剂盒（TaKaRa公司）进行cDNA第一链合成，作为基因克隆的PCR反应模板。利用植 物基因组DNA提取试剂盒（天根公司）提取DNA，作为扩增内含子的PCR反应模板。
[0053] 3)根据自缺刻缘绿藻转录组高通量文库中筛选到1条与已知物种Δ9FAD基因同 源的contig序列（Contigl6329)设计基因特异性引物（genespecificprimers，GSP)Seq 1(SEQIDΝ0· 1)和Seq2(SEQIDΝ0· 2)，按照SMART?RACEcDNA扩增试剂盒（Clontech 公司）的使用说明分别建立5' -RACE和3' -RACE反转录体系，然后应用降落PCR原理进 行扩增。25yL的Y-RACE反应体系包含：17yL的PCR级水、2.5yL的lOXAdvantage 2PCR缓冲液、0· 5yL的dNTP、0. 5yL引物（Seq1)、2· 5yL的 10XUPM、L5yL的 5'-RACE cDNA、0.5yL的50XAdvantage2聚合酶混合液。：V-端的反应体系，除0.5yL的引物 (Seq2)和1. 5yL的:V-RACEcDNA外，其它的同Y-端反应体系。反应程序：94°C变性 3〇8,72°(：延伸15〇8,5个循环；94°(：变性3〇8,70°(：退火3〇8,72°(：延伸15〇8,5个循环 ；941€ 变性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，30个循环；72°C延伸7min。随后，对RACE产物进行 电泳（图1)和胶回收，然后连接到PMD19-T载体（图2)并转化到大肠杆菌（Escherichia coli)DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，经菌落PCR验证后送往上海生工 生物工程公司测序。将测序得到的5' -和3' -RACE片段与已知片段的序列进行拼接，并重 新设计引物及测序验证，得到了A9FAD基因的全长cDNA序列（Seq3，SEQIDN0. 3)。
[0054] 该序列全长2442bp，其中，5'-非翻译区（UTR)和3'-UTR分别为157bp和986bp， 开读阅读框（〇RF)长为1299bp，编码432个氨基酸残基（Seq15,SEQIDNO. 15)。根据 全长cDNA序列设计四对基因特异引物Seq4(SEQIDNO. 4)和Seq5(SEQIDNO. 5)、Seq 6(SEQIDNO. 6)和Seq7(SEQIDNO. 7)、Seq8(SEQIDNO. 8)和Seq9(SEQIDNO. 9)及 Seq10(SEQIDNO. 10)和Seq11(SEQIDNO. 11)，分别进行内含子扩增。反应体系包括： 1.0yLDNA模板，引物各 0.5yL，10.5yL的无RNase水，12.5yL2XTaqPCRMasterMix。 PCR反应条件：95°C预变性5min，36个循环包含94°C变性lmin、68. 5°C退火lmin以及72°C 延伸3min;最后72°C延伸10min。PCR产物按上述方法经胶回收、克隆、蓝白斑筛选、菌落 PCR验证和测序，并将测序结果与原0RF区拼接，得到Δ9FAD基因的DNA序列（Seq12,SEQ IDΝ0· 12)。
[0055] 利用Blastx搜索结果显示缺刻缘绿藻A9FAD基因0RF区所编码的蛋白质与莱 茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)硬脂酰-ACP去饱和酶蛋白具有65%的相似度。 ChloroP1.1Server预测其N端具有61个氨基酸残基组成的叶绿体转运肽。在生物体内， 转运肽是把胞质中合成的目标蛋白运送到相应细胞器的靶向蛋白，目标蛋白在进入细胞器 时，该转运肽就会被肽酶切除。因此在进行目的基因的功能鉴定时，应排除转运肽序列。
[0056] 4)根据pYES2载体和Δ9FAD基因不含叶绿体转运肽的0RF序列（Seq3的第 341bp至第1 453bp)设计引物Seq13(SEQID勵.13，第]^卩至26卩为保护碱基，第36卩至 8bp为EcoRI酶切位点）和Seq14(SEQIDNO. 14,第lbp至2bp为保护碱基，第3bp至8bp 为Xbal酶切位点）。以缺刻缘绿藻的cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系如下：1. 0μL cDNA模板，引物Seq13 和Seq14 各 0· 5μL，10. 5μL的无RNase水，12. 5μL2XTaqPCR MasterMix。PCR反应条件：95°C预变性5min，36个循环包含94°C变性lmin、68. 5°C退火 lmin以及72°C延伸90s，最后72°C延伸lOmin。PCR产物按上述方法经胶回收、克隆、蓝白斑 筛选、菌落PCR验证和测序，以确保目的基因序列的准确性。这样就获得了pMD19T-A9FAD 质粒。
[0057] 5)将携带正确目的基因序列的大肠杆菌进行培养，然后抽提pMD19T-Δ9FAD质 粒，用限制性内切酶EcoRI和Xbal进行双酶切消化反应。同时对提取的pYES2质粒也进 行EcoRI和Xbal双酶切反应。反应体系为2μL的10XM缓冲液，4μL的0. 1%BSA，DNA 2μg，EcoRI及Xbal各1μL，加无RNase水至20μL。37°C消化反应4h。将酶切后的产物 进行电泳后割胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶将酶切后的△ 9FAD基因片段与pYES2片 段连接得到重组载体pY-A9FAD。连接反应体系为：2. 5μL的连接缓冲液，Δ9FAD基因DNA 约 0· 3pmol，载体pYES2 的DNA约 0· 03pmol，1μL的T4DNA连接酶，加无RNase水至 25μL， 16°C连接过夜。连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，利用含50mg/L氨苄（Amp)的LB培 养基筛选，菌落PCR和测序以确保序列的准确性。从大肠杆菌DH5a中抽提PY- △ 9FAD质 粒，-20 °C保存备用。
[0058] 6)酵母感受态细胞制备。将酵母接种于含0. 005%LA的YH)培养基中，28°C复苏 培养过夜，然后按1:100放大培养，以250rpm转速振荡培养至细胞密度约