再加入2mL培养液吹 打各孔底壁，细胞彻底脱壁后，吸入离屯、管中。（2)离屯、细胞：将离屯、管置于低速离屯、机中， 于1500巧m离屯、5min后，弃去上清液；加入12血PBS液重悬细胞，再于1500巧m离屯、5min， 弃上清液；再滴入3mL的PBS液于离屯、管中重悬细胞后，将细胞悬液吸至流式细胞仪专用上 机管中，150化pm离屯、5min后，弃上清液。
[0042] 3. 3Annexin-V-門TC和PI双标记活细胞法检测细胞调亡
[0043] (1)用微量加样器向流式管中加入10yL的Annexin-V-FITC和5yL的PI(两种 试剂勿相混，勿和管底细胞相接触）。（2)加入200yL结合缓冲液，将Annexin-V-FITC和 PI冲至管底与细胞相混，并轻轻吹打，形成单细胞悬液。（3)避光反应15min或放入4°C冰 箱30min。（4)上机前加入300yLPBS结合缓冲液，并轻轻吹打，而后立刻上机（流式细胞 仪）检测。光源为488nm氣离子激光器，每份标本收集细胞10000个，FITC受激发后发绿 色巧光，PI发红色巧光。（5)经流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的散点图，图上每一 个点代表一个细胞，都具有两个参数值。左上Ql象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞 (An-PI+)，右上Q2象限代表晚期调亡细胞和坏死细胞（An+PI+)，左下Q3象限代表正常细胞 (An-PI-)，右下Q4象限代表早期调亡细胞（An+PI-)。
[0044] 4、统计学分析
[0045] 使用统计学软件SPSS10. 0进行统计分析。（1)使用析因设计的方差分析，对相同 药物浓度不同处理时间、相同处理时间不同药物浓度各组之间化合物（I)对SACC-M细胞 的生长抑制率进行两两比较。（2)使用简单相关分析，分析生长抑制率与作用时间之间、抑 制率与药物浓度之间的相关性，得出相关系数r，并对r值进行t检验，从而得出药效随时间 和浓度的变化关系。（3)使用二项分布的U检验对流式细胞术检测的各用药组及对照组的 调亡率进行统计分析。
[0046]S、结果及结论
[0047] UMTT比色试验 柳4引 （1)实验表明化合物（I)对SACC-M细胞有明显的增殖抑制作用，药物作用24、 48、7化后最高抑制率可达80.4% (表1)。（2)相同处理时间、不同浓度组之间的抑制率比 较有明显差异（P<〇. 01);相同浓度组、不同处理时间之间的抑制率有明显差异（P<〇. 01); 药物浓度和处理时间无交互作用（P= 0. 901)。（3)组间两两比较：相同时间、不同浓度组 之间，抑制率有明显差异（P<〇. 01);处理2地、4她、7化后，同一浓度、不同时间组之间有明 显差异（P<〇. 01)。（3)药效（抑制率）与作用时间和药物浓度均具有正相关性，抑制率与 作用时间具有正相关性（r= 0. 291，P= 0. 042);抑制率与浓度具有正相关性（r= 0. 926， P<0. 001)O W例 2、流式细胞术检测 阳化日]2.1对照组细胞的调亡情况
[0051] 对照组（正常调亡组）细胞均属于自然调亡，24h时其调亡率为4. 9 %，4化时的调 亡率为7.1%，7化的调亡率为6.1% (表2)，调亡率随培养时间差别不大，无统计学意义。
[0052] 2. 2用药组细胞随时间变化调亡情况
[0053] 经12. 5mmol/L化合物（I)处理2地后，其调亡率为25. 5% ;处理4化后，调亡 率上升至40. 9 %，多为早期调亡；处理7化后，调亡率为67.6%，多为晚期调亡，细胞调亡率 随着处理时间延长而明显上升（表2)，各时间组之间调亡率有统计学意义（P<0. 01)。
[0054] 2. 3用药组细胞随浓度变化调亡情况 阳化5] 处理7化后，2. 5、5. 0、7. 5、10. 0、12. 5mmol/L化合物（I)组的细胞调亡率分别为 16 %、24. 2 %、26.I%、66. 3 %、67.6%，且在药物浓度达到12. 5mmol/L时，晚期调亡率明显 增大（表2)，各药物浓度组间调亡率有统计学意义（P<0. 01)。
[0056] 结论，本研究表明化合物（I)具有诱导SACC-M调亡的作用，且调亡率随药物作 用时间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势。应用化合物（I)治疗腺样囊性癌有可能成 为一种很有前景的治疗方法。
[0057] 表1不同浓度不同作用时间抑制率（均值±SD)
[0059] 表2化合物（I)诱导SACC-M调亡情况
阳061] 实施例3
[0062] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。 W63] 实施例4 W64] 口服液制备：按实施例I方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。 W65] 实施例5
[0066] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。 W67] 实施例6
[0068] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。 W例 实施例7
[0070] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫冷冻干燥后无菌 烙封得粉针剂。
[0071] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将 茵陈的干燥地上部分粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次 用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正 丁醇萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体 积，再用75 %乙醇洗脱8个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸 膏；（c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、65:1、30:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶 进一步分离，依次用体积比为25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲 醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流 提取采用的乙醇浓度为80 %。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗涎腺腺样囊性癌药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗涎腺腺样囊性癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的三萜化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的三萜化合物，可以从茵陈的干燥地上部分中提取、分离纯化得到。本研究证实该化合物具有诱导SACC-M凋亡的作用，且凋亡率随药物作用时间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势，可以用来开发成治疗涎腺腺样囊性癌的药物。
【IPC分类】C07J71/00, A61P35/00, A61K31/585
【公开号】CN105294817
【申请号】CN201510836820
【发明人】吕涛
【申请人】吕涛
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月25日