一种与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记、其获取方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家禽基因工程的技术领域，更具体地，涉及一种与高邮鸭体重、胸腿肌 重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记、其获取方法及应用。
【背景技术】
[0002] 胰岛素增长因子-l(IGF-l)属胰岛素家族成员，是动物生长轴的重要基因之一， 具有促进细胞增殖和个体发育的功能。IGF-1可通过靶器官上的IGFs受体，促进蛋白合成， 肌肉干细胞增殖、成肌细胞分化及肌管融合等，从而促进骨骼肌的发育。试验发现，在鸭胚 胎期，蛋内注射外源IGF-1可以显著提高出雏后鸭的体重和胸肌重，说明IGF-I对雏鸭的生 长具有促进作用。
[0003] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子标记，具有数量 多、分布广、代表性强和遗传稳定性好等特点。目前已经在动植物的遗传多样性分析、基因 作图、分子标记辅助育种和功能基因学的研究中得到了广泛的应用。结合PCR技术、电泳、 荧光灯方法的SNP检测方法，在动植物遗传育种中起到重要作用。高邮鸭是全国三大名鸭 之一，生长发育快，肉质好，属于肉蛋兼用型地方品种。在育种工作中，与改变个体遗传特性 (人工诱变）相比较，改变品种遗传结构相对容易。而现有技术中尚未发现与与高邮鸭体 重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记与应用。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸 肌肌纤维性状相关的分子标记、其获得方法及应用。
[0005] 本发明提供了一种与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记， 所述分子标记位于SEQ ID NO: 1所示核苷酸的第190位，该位点的核苷酸为G或T。
[0006] 本发明还提供了一种获取与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子 标记的方法，PCR扩增高邮鸭基因组DNA，扩增产物经连接酶检测反应后测序，通过序列分 析获取与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记。
[0007] 其中，PCR扩增所用引物对序列如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。
[0008] 其中，连接酶检测反应所用探针序列如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6 所示。
[0009] 其中，连接酶检测反应产物长度170bp的为基因型GG，连接酶检测反应产物长度 172bp的为基因型TT，连接酶检测反应产物长度170bp和172bp的为基因型GT。
[0010] 本发明还提供了一种与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记 在筛选高邮鸭体重、胸腿肌重及胸肌肌纤维性状中的应用。
[0011] 本发明的有益效果：本发明提供了一种与高邮鸭体重、胸腿肌重及胸肌肌纤维性 状相关的分子标记，针对该分子标记位点的单核苷酸多态性，设计特定的引物扩增包含SNP 位点的基因片段，然后进行连接酶检测反应，测序分析，能够简单、快速、成本低、精确的检 测其单核苷酸的多态性。对上述分子位点的基因型与高邮鸭70日龄体重、胸腿肌重和胸肌 肌纤维性状进行关联分析，可以用于家系选育中的早期选择，在选配中提供分子依据，以提 高高邮鸭上市时的体重，增加经济效益。
【附图说明】
[0012] 图1是ABI3730型基因分析仪检测与Genemapper分析结果。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
[0014] 本发明的与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记，所述分子 标记位于SEQ ID NO: 1所示核苷酸的第190位，该位点的核苷酸为G或T，导致该基因位点 的单核苷酸多态性。PCR扩增得到与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标 记，其核苷酸序列为鸭IGF-1的部分基因组序列，序列如SEQ ID NO: 1所示。该序列中的第 190bp处有一个G190-T190的突变，导致该位点的单核苷酸多态性。
[0015] 针对上述位点的单核苷酸多态性，本发明还公开了其获取的方法，其中用于扩增 所述IGF-1基因和检测该基因位点突变的正反向引物对序列如SEQ ID N0:2-3所示。
[0016] 其中用于对上述扩增产物进行连接酶检测反应（LDR)，所需的LDR探针序列如SEQ ID NO :4-6 所示。
[0017] 本发明的与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记用于筛选高 邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状。
[0018] 本发明的获取与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记的方 法，包括以下步骤：
[0019] 1、鸭血样的采集
[0020] 本发明的试验鸭来自江苏省高邮鸭集团，在相同的日粮水平下饲喂的同日龄高邮 鸭和金定鸭种鸭群。采用一次性注射器从鸭翅下静脉中抽取lml血液，注入经高压灭菌并 装有200 μ 1 2%无菌的乙二胺四乙酸（EDTA)抗凝剂的1. 5ml离心管中，轻轻摇勾，记录翅 号，-80 °C保存备用。
[0021] 2、DNA 的提取
[0022] 基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法
[0023] (1)取上述全血30 μ 1置于1.5ml离心管，分别加入470 μ 1 1XSET缓冲液、 12. 5 μ 1 20% SDS (十二烷基硫酸钠）和6 μ 1的10mg/ml蛋白酶Κ，混合均匀后放于55°C 水浴过夜；
[0024] (2)取出样本于1. 5ml离心管，加入500 μ 1饱和苯酚，轻摇20min，lOOOOrpm离心 10min ；
[0025] (3)取上清，再次加入500 μ 1饱和苯酚，轻摇20min，lOOOOrpm离心10min ;
[0026] (4)取上清，加入500 μ 1氯仿-异戊醇（23 :1)轻摇20min，lOOOOrpm离心10min ;
[0027] (5)取上清，加入lml冰无水乙醇（-20°C )，来回摇摆以沉淀DNA，lOOOOrpm离心 lOmin后倒出乙醇；
[0028] (6)用1ml 75%乙醇清洗DNA -次，倒掉乙醇，置于50°C干燥箱内烘干；
[0029] (7)待DNA完全干燥后加入300 μ 1灭菌后的双蒸水溶解，50°C水浴锅中过夜以溶 解DNA ;将DNA原液1 :100稀释并进行分光光度计检测浓度，0D值为1. 85-1. 94。
[0030] (8)将DNA浓度稀释到50ng/ μ 1，存放于-20°c冰箱中保存备用。
[0031] 3、PCR 扩增
[0032] 扩增包含G190T位点的片段：根据GenBank的鸭IGF-1基因（NW_004677293)全序 列设计包含该位点的正反向引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以上述高 邮鸭基因组为模板，在包含待测位点序列的正反向引物、Taq DNA聚合酶、缓冲环境、dNTPs 存在的情况下，在PCR反应条件下进行扩增，PCR产物大小为232bp，用于LDR反应。
[0033] 所述引物对序列如下：
[0034] 上游引物序列为：5'-TTGCATGGAGTGGATGTGAT-3'（SEQ ID NO :2);
[0035] 下游引物序列为：5'-GCAGGAATAAGAGTGCCATGT-3'（SEQ ID NO :3)
[0036] PCR扩增反应的具体步骤为：
[0037] 1) PCR扩增反应体系准备：在200 μ 1的PCR薄壁管中，加入1 μ 1 DNA模板（50ng/ μ1)、2μ1 Bufer、0.6yl Mg2+(3mmol/L)、2yl dNTP(2mmol/L)、0.2yl Taq DNA 聚合酶 (5υ/μ1)、2μ1 Primer π?χ、12·2μ1 ddH20，共20μ1 PCR反应体系，充分混匀后短暂离心， 最后加入20 μ 1石錯油。
[0038] 2)PCR 扩增反应程序设置：在 Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600 上进 行扩增反应，PCR扩增反应程序为：95°C变性2min，40次循环（94°C 90s，50°C lmin 30s， 65°C 30s)65°C延伸lOmin，得到PCR扩增产物。
[0039] 3)反应结束后，取2 μ 1反应产