鉴定西瓜枯萎病的InDel分子标记及其引物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种鉴定西瓜枯萎病的InDel分子标记及 其引物和应用。
【背景技术】
[0002] 枯萎病（化sariumwilt,FW)，由半知菌亚口镶抱属菌西瓜专化型（fon)寄生引 起，是世界范围内西瓜生产中导致产量和品质降低最严重的一种真菌±传病害。目前，已报 道的fon生理小种有0、1、2和3共四种，除了化n3,不同的商业西瓜品种在一定程度上已经 整合了生理小种化nO、化nl和化n2的抗性。但是，大部分品种不抗枯萎病，病菌能够在西 瓜种植区很快的扩散和蔓延。因此，开发与枯萎病抗性紧密连锁的易于操作、成本低廉的分 子标记，不仅可W在苗期快速鉴定抗枯萎病品种/系，缩短育种周期，还有利于改良西瓜的 枯萎病抗性，为西瓜抗病育种提供技术支撑。
[0003] 最近，Lambel等（2014)利用SNP标记定位了一个西瓜化nl抗性的主效的'L位 点，位于1号染色体遗传图谱的2. 3~8. 4cM，对应于1号染色体物理图谱的56050~ 6541994bp。许勇课题组也根据SNP位点开发了与化nl紧密连锁的两个CAPs/dCAPs标记， 分别为7716_fon和502124_fon，对应于1号染色体物理图谱的459624和502124bp，并且 502124_fon与化η1连锁的程度更紧密些。
[0004] 现有的已开发的西瓜化nl抗性紧密连锁的分子标记为CAPS/dCAPs标记，检测过 程需要酶切，成本较高，步骤繁琐。基于全基因组重测序的插入/缺失（InDel)标记为共显 性标记，检测容易，成本低廉，但尚存在一些不如意之处，如变异较少、稳定性不够等。
【发明内容】
[0005] 本发明通过QTL(quantitativetraitlocus,数量性状基因座)初定位在1号染 色体定位到了抗化nl的主效的1，并结合亲本重测序制备到与西瓜枯萎病抗性紧密连锁的 InDel分子标记及其引物和在西瓜抗枯萎病育种中的应用，可为西瓜枯萎病抗性提供新手 段，加速西瓜枯萎病抗性性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 设计一种鉴定西瓜枯萎病的InDel分子标记，其核巧酸序列为：TTTATTTTTTATTTTTTATTT〇
[0007] 上述InDel分子标记的引物，包括W下的核巧酸序列： InDell_fonlF：TTCCAAAAGTGCAGATTTC； InDell_fonlR:CACATGGGGATTGACTAAG。
[0008]鉴定西瓜枯萎病的InDel分子标记的筛选方法，包括w下步骤： (1) 利用母本"ZXG01478"(高抗枯萎病)和父本"14CB11"(高感枯萎病)杂交的F2群体 构建高密度的遗传连锁图谱，并对父母本、Fi和F2群体的93个单株进行枯萎病抗性鉴定； (2) 结合遗传连锁图谱和枯萎病抗性鉴定，可利用WinQ化cartographer2. 5 software化ttp: //statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)进行QTL初定位，在LGl鉴 定到一个枯萎病抗性相关的的'L位点化nl，其LOD峰值为26. 05,解释80. 18%的表型变异， 置信区间对应的物理位置为1号染色体的193331~277557化P; (3) 结合两个亲本的重测序，在QTL区间发现19个插入缺失片段大于20bp的InDels， 为了缩小候选基因的范围，进一步把的'L区域划分为5段，根据位于端点位置的插入缺失设 计InDel分子标记，设计对应的InDel引物； (4) 利用对应的InDel引物在父母本、Fi和F2群体中进行基因型鉴定； (5) 加上InDel分子标记的基因型鉴定结果与LG1上的其他SNP标记利用JoinMap4. 0 进行图谱构建，并利用WinQTLcartogra地er2. 5software进行QTL的重新扫描；结果显 示其中一个分子标记，InDell_fonl出现在该QTL的峰点，并且L0D值为31. 65,解释91. 46% 的表型变异，Q化置信区间对应的物理位置同样为1号染色体的193331~277557化P。
[0009] 利用上述技术措施，申请人最终获得了与西瓜枯萎病抗性紧密连锁的插入缺失标 记InDell_fonl，其对应的西瓜参考基因组物理图谱的位置为1号染色体的464377bp，序列 为TTTATTTTTTATTTTTTATTT，引物序列为， InDell_fon1F:TTCCAAAAGTGCAGATTTC; InDell_fonlR:CACATGGGGATTGACTAAG。
[0010] 标记位点InDell_fonl对应的LOD值为31. 65,解释91. 46%的表型变异。
[0011] 上述鉴定西瓜枯萎病的InDel分子标记在西瓜枯萎病抗性育种中的应用方法，包 括如下步骤： (1) 对F2群体的93个单株利用所述分子标记InDell_fonl进行基因型鉴定； (2) 利用上述（1)分析结果根据分子标记InDell_fonl的基因型对不同单株进行分 类，并利用枯萎病抗性鉴定数据进行鉴定和验证。
[0012] 本发明具有W下积极有益的技术效果： 本发明InDel分子标记变异稳定、检测容易，不需要酶切等繁琐的步骤，并且成本低 廉(相对于已开发的CAPS/dCAPs标记)，提高了西瓜枯萎病抗性育种的选择效率和准确 率，从而最大限度的加快育种进程；此外，此标记位于的'L的峰值，解释很大的表型贡献率 (91. 46%)，加快了西瓜枯萎病抗性基因的克隆和功能验证。
【附图说明】
[0013]图1F2群体的枯萎病抗性鉴定结果分布图。
[0014] 图2筛选InDell_fonl分子标记前后giL扫描结果比较。字体加粗和下划线的是 QTL化nl的峰值位置分子标记尤虹omosomel上加粗的标记是新筛选的InDel分子标记。 [001引图3利用分子标记InDell_hnl的引物在部分F2群体基因组DNA中的扩增结果。 父母本方框中条带为目的条带。名称皆为品种名称\代号的后两/Ξ位。
[0016] 图4利用分子标记hn_7716的引物在部分F2群体基因组DNA中的扩增结果。父 母本方框中条带为目的条带。名称皆为品种名称\代号的后两/Ξ位。
【具体实施方式】
[0017]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合具体实施例，对本 发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用w解释本发明，并不用于 限定本发明。W下实施例中所设及的原料，如无特别说明均为市售，所设及检测方法如无特 别说明，则均为常规方法。
[001引 实施例1 西瓜枯萎病抗性鉴定，具体步骤如下： (1) 菌±的准备：将菌种从溫箱培养的西瓜枯萎病植株上分离培养，使用前用麦粒扩繁 培养后与灭菌沙±按1 :50比例混合均匀，备用； (2) 种子准备：每品种取种100粒，室溫浸种24小时，33°C催芽36小时播种； (3) 接种鉴定：采用麦粒沙菌±法，将准备好的菌±用营养鉢装好，溫室内加溫苗床播 种，每营养鉢5粒，两次重复，设感病和抗病对照和保护行； (4) 病情调查：播种10天后开始发病，记载出苗和发病情况，4周左右待感病和抗病对 照品种分别达到预期病级后，最后一次统计各品种的活苗数，计算病情； (5) 病情计算方法： 死苗率（％)=(出苗数一活苗数）/出苗数X100%; (6) 抗病性分级： 高抗化时：0《死苗率《20% ; 抗病佩：20% <死苗率《40% ; 中抗（MR) :40% <死苗率《60% ; 感病做：60% <死苗率《80% ; 高感化巧：死苗率> 80%。
[001引实施例2 鉴定西瓜枯萎病InDel分子标记的开发方法，具体步骤如下： (1)枯萎病抗性全基因组giL初定位 利用母本"ZXG01478"(高抗枯萎病)和父本"14CB11"(高感枯萎病)杂交获得的F2群体 已经构建了高密度的遗传连锁图谱(通过分子标签间的mLOD值进行了连锁分群，见表1)， 并对父母本、Fi和F2群体的93个单株进行枯萎病抗性鉴定；结合遗传连锁图谱和F2群体 枯萎病抗性鉴定结果（图 1)，利用WinQTLcartographer2. 5software化ttp://statgen. ncsu.e化/qtlcart/WQTLCart.htm)进行的'L初定位，在LGl连锁群鉴定到一个枯萎病抗性 相关的的'L位点化nl，其L0D峰值为26. 05,解释80. 18%的表型变异，置信区间对应的物理 位置为1号染色体的193331~277557化P(表2)。
[0020] 表1 遗传连锁图谱
表2高密度图谱和加上两个InDel标记后QTL扫描信息
[0021] (2)父母本的重测序 利用母本"ZXG01478"搞抗枯萎病）和父本"14CB11"搞感枯萎病）进行了 22x深度 的高通量重测序。两个亲本共检测到45134个小的InDel。
[0022] (3)QTL区域InDel标记的开发 在的'L定位的区间发现19个插入缺失片段大于20bp的InDels。为了缩小候选基因 的区域，把的'L区域划分为5段，根据位于端点位置/附近的插入缺失设计InDel引物，共 设计6对InDel引物。利用程序提取插入缺失相应位置前后各5(K)bp的序列，设计对应的 InDel分子标记。
[002引 实施例3 西瓜F2群体分子标记分析，包括W下步骤： (I) 利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下： (J) 取1g新鲜叶片放入研鉢，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1mlCTAB抽取液 的离