屯、管中，使二者充分混匀，然后置于65°C恒溫水浴60min,其间颠倒混合2-3次； (g;从水浴锅取出后，8000巧m离屯、1min; (|)取上清液置于另一离屯、管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24 :1，V/V)，轻轻颠倒使 其充分混匀； (袭10000巧m离屯、5min,取上清液(尽量不取到中层沉淀）； fg;加入0.7倍体积的异丙醇（需提前预冷30min),混匀后置于-20°C冷冻不超过 30min让DM析出；取出后10000巧m离屯、5min,留沉淀弃上清液； (g)用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离屯、管盖子惊干； (2)加入200μ1的蒸馈水溶解DNA;用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20 °C冰 箱中保存备用。
[0024] (2)PCR反应体系和程序 反应体系如下：
PCR反应程序为：94°C5分钟，35个循环的94°C20秒钟、55°C1分钟、72°C30秒、72°C5 分钟。
[00巧](3)对PCR产物进行8%聚丙締酷胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。
[002引賴试剂配制： A. 5XTBE: Tris-base 53. 9 克 邸TA 3. 72克 棚酸 27. 5克 用蒸馈水定容至1升。
[0027]B. 40%聚丙締酷胺溶液： 聚丙締酷胺 193. 34克 甲叉双丙締酷胺 6. 66克 用蒸馈水定容至500毫升。
[0028] C. 8%聚丙締酷胺凝胶(现配现用）： 40%聚丙締酷胺溶液 10毫升 5XT邸 5毫升 10%过硫酸锭（APS) 200微升 四甲基乙二胺（TEMED) 80微升 蒸馈水 22毫升。 化银染液： 硝酸银 1克 冰醋酸 5毫升 无水乙醇 50毫升 用去离子水定容至500毫升。
[002引E.显影液： 氨氧化钢 15克 甲醒（37%) 2. 5毫升 用去离子水定容至500毫升。
[0030] @凝胶板准备： 玻璃板用蒸馈水洗净、惊干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，惊干。将凹板和平 板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子(一个制胶器可制作两板凝胶)。在洗 瓶内配置8%聚丙締酷胺凝胶溶液(两份)，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入 有齿的梳子(不要让梳子齿的下方产生气泡）；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝 固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。
[0031]、'享电泳： 将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块 玻璃板中间倒入适量的1XTBE缓冲液。在PCR产物中加入0. 2倍体积的6XDNALoading Buffer,混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。
[00础 g)染色和显影： 电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，擦去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将 平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶 取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰 后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。
[003引（霉;带型判读： 将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。
[0034] 实施例4 F2群体遗传连锁图谱重构建和的'L重定位，其步骤如下： (1)加上InDel分子标记在F2群体的基因型鉴定和LG1上其它的SNP标记利用商业途 径获得的J〇inMap4. 0进行图谱构建。加上InDel标记后，LG1的头尾顺序发生了颠倒，但 是该标记和周围的SNP标记均定位在同一个scafTo1d上，并且和基因组物理图谱的共线性 一致（图2)。
[0035] (2)利用新构建的图谱对giL重新定位按照实施例2中的（1)进行。结果如表2所 示，其中新开发的一个分子标记InDell_fonl出现在该QTL的峰值，并且L0D值为31. 65， 解释91. 46%的表型变异，Q化置信区间对应的物理位置同样为1号染色体的193331~ 277557化P。
[0036] 位于峰顶的分子标记InDell_hnl对应于1号染色体464377bp的一个 21bp插入缺失，其序列为TTTATTTTTTATTTTTTATTT，其引物序列为InDell_fonlF: TTCCAAAAGTGCAGATTTC;InDell_fonlR:CACATGGGGATTGACTAAG。该引物在母本（高抗枯萎 病品种）中的扩增产物为33化P，在父本(易感枯萎病品种）中的扩增产物为35化P。加上该 InDel标记后，枯萎病抗性QTL化nl的L0D峰值更高，解释的表型贡献率更大，说明该标记 和QTL的连锁程度很紧密。
[0037] 实施例5 一种实施例4所筛选InDel分子标记在育种中的应用，其应用步骤如下： (1)如实施例3进行InDell_fonl分子标记在Fz群体中的基因型鉴定（图3)。
[003引（2)如实施例3进行Fz群体的枯萎病抗性鉴定。
[0039] (3)检查InDell_hnl分子标记的两种基因型（A代表母本带型，B代表父本带型， AB代表杂合基因型）在93个F2群体中的分布情况(表3)。
[0040] 结果表明，分子标记InDell_fonl的基因型在71份抗病(死苗率<60%)株系中22 份为A(33化p)，l份为B(35化p)，49份为AB。而在20份感病株系中，有18份为B(35化P)， 2份为AB，并且所有的的B基因型单株皆是高感(死苗>80%)株系。
[0041] 分子标记InDell_fonl的基因型为A的22个株系都是抗病株系，而在基因型为B 的19个株系18个是高感株系，1个是抗病株系(死苗率=32. 6%)。其基因型鉴定的准确率 达到 97. 56〇/〇。
[0042] (4)还利用已发表的CAPS标记化n_7716如实施例3中对F2群体各个单株进行 PCR扩增，然后使用限制性内切酶化gl进行酶切，最后如实施例3中使用8%聚丙締酷胺凝 胶电泳、显影、染色和带型判读（图4)。结果显示(表3~6)，hn_7716和InDell_fonl在尸2 群体93个单株的基因型完全一致，进一步验证了本发明的鉴定结果。
[0043]W上的结果足W说明通过分子标记InDell_fonl来预测西瓜枯萎病抗性，可W提 高西瓜枯萎病抗性育种的选择效率，从而加速育种进程。
[0044] 表3InDell_Fonl和fon_7716在Fz群体中的鉴定和验证
表4InDell_Fonl和化n_7716在Fz群体中的鉴定和验证(续）
表5InDell_Fonl和化n_7716在Fz群体中的鉴定和验证(续）
【主权项】
1. 一种鉴定西瓜枯萎病的InDel分子标记，其核苷酸序列为： TTTATTTTTTATTTTTTATTT〇2. -种权利要求1所述InDel分子标记的引物，包括以下的核苷酸序列： InDell_fonlF：TTCCAAAAGTGCAGATTTC； InDell_fonlR:CACATGGGGATTGACTAAG。3. -种权利要求1所述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤： (1) 利用高抗枯萎病型母本和高感枯萎病型父本杂交的F2群体构建高密度的遗传连锁 图谱，并对父母本、匕和F2群体的单株进行枯萎病抗性鉴定； (2) 结合遗传连锁图谱和枯萎病抗性鉴定，进行QTL初定位，在LG1连锁群鉴定枯萎病 抗性相关的QTL位点fonl; (3) 结合两个亲本的重测序，在QTL区间查找插入缺失片段大于20bp的InDels，为了 缩小候选基因的区域，将QTL区域划分为5段，根据位于端点位置的插入缺失设计InDel分 子标记，设计对应的InDel引物； (4) 利用对应的InDel引物在父母本、匕和F2群体中进行基因型鉴定； (5) 加上InDel分子标记的基因型鉴定结果和LG1上的其他SNP标记利用JoinMap4. 0 进行图谱构建，并利用WinQTLcartographer2.5software进行QTL的重新扫描。4. 权利要求1所述InDel分子标记或权利要求2所述引物在西瓜枯萎病抗性的分子标 记辅助选择中的应用。5. 权利要求1所述InDel分子标记在西瓜枯萎病抗性的分子标记辅助选择中的应用方 法，包括如下步骤： (1) 对匕群体的单株利用所述分子标记进行基因型鉴定； (2) 利用上述（1)分析结果根据分子标记的基因型对不同单株进行分类，并利用枯萎病 抗性鉴定数据进行鉴定和验证。6. 权利要求1所述InDel分子标记或权利要求2所述引物在西瓜枯萎病抗性基因图位 克隆中的应用。
【专利摘要】本发明具体涉及一种鉴定西瓜枯萎病的InDel分子标记及其引物和在西瓜抗枯萎病育种中的应用。该InDel分子标记的核苷酸序列为：TTTATTTTTTATTTTTTATTT，其引物序列：InDel1_fon1F：TTCCAAAAGTGCAGATTTC；InDel1_fon1R：CACATGGGGATTGACTAAG。本发明通过QTL初定位同样在1号染色体定位到了抗fon1的主效QTL，并结合亲本重测序制备到与西瓜枯萎病抗性紧密连锁的InDel分子标记及其引物和在西瓜抗枯萎病育种中的应用，可为西瓜枯萎病抗性提供新手段，加速西瓜枯萎病抗性性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105331615
【申请号】CN201510899021
【发明人】李娜, 尚建立, 马双武, 王吉明, 李楠楠
【申请人】中国农业科学院郑州果树研究所
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月9日