一种犀角金线鲃心脏细胞系的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用犀角金线鈀心脏组织建立细胞系的方法，属于淡水水生生物 细胞培养和超低温冷冻保存的技术领域。
【背景技术】
[0002] 犀角金线|巴Sinocyclocheilusrhinocerous(Regan，1904)隶属于趣形目 (Cypriniformes)趣科（Cyprinidae)金线祀属（Sinocyclocheilus)，是1994年发表的一 洞穴新种，目前，本种已知的分布点为云南罗平县环城乡的地下河，属南盘江水系，对它的 研究也仅见于其分类特征的描述、分类地位的确认及其系统发育关系。
[0003] 因犀角金线鈀种群数量较小，且不易获得，因此，如何保护和保存这一珍稀洞穴鱼 类的种质资源成为现今亟待解决的问题。塘养环境下，犀角金线鈀还不能实现性腺的正常 发育成熟，实现更进一步的人工繁殖还存在一定困难，因此，通过保存其精子、卵子、胚胎、 个体等来保存其种质资源的方法已不可行，所以发明人将目光投向了犀角金线鈀的体细胞 培养。
[0004] 犀角金线鈀生活于地下水环境中并表现出了一系列的适应性特征，比如眼睛的退 化、鳞片数量的减少、感觉系统的高度发达等，但它又不像安水金线鈀那样，某些特征退化 的很彻底，它是洞穴鱼类对洞穴适应的一个过渡类型，因此是洞穴适应性研究中不可或缺 的研究对象，而细胞培养的成功为在细胞水平上探索犀角金线鈀对地下水环境的适应性机 制奠定了基础。
[0005] 鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今已建立了 280余株细胞系，中国的鱼 类细胞培养历经30多年，只建立了 50余株细胞系，建立细胞系的物种不足中国鱼类总数的 1. 5% (中国鱼类超过3500种），由此可见，细胞系的构建速度是非常缓慢的，关注度不够、 参与的工作者较少可能是其原因之一；其次，相较于哺乳动物细胞培养，鱼类细胞培养中更 易发生污染，导致失败率上升，而现有的专利或文章中大多将这一现象归结为技术不过关， 而嫌少注重鱼体本身的质量问题，在犀角金线鈀细胞培养实践中，鱼体的生活状态也直接 影响了细胞系构建的成败；另外，因犀角金线鈀野外生境的局限性，对其生活习性的了解较 少，这也在一定程度上加大了犀角金线鈀细胞培养的难度。因此，犀角金线鈀心脏细胞系的 成功构建是建立在长期对犀角金线鈀野生和塘养生态习性了解的基础上，同时，犀角金线 鈀是中国首个实现心脏细胞培养的洞穴鱼类，此细胞系也是中国洞穴鱼类的首个心脏细胞 系。经文献检索，未见与本发明的相同报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种操作简便易行的犀角金线鈀心脏细胞系的构建方法，以 满足对犀角金线鈀洞穴适应性研究、快速核型分析和种质资源保存的需要。
[0007] 具体地，根据本发明的一个方面，提供了一种犀角金线鈀心脏细胞系的构建方法， 该构建方法包括如下步骤：1)犀角金线鈀心脏的获取：先用50IU/1的青霉素浸泡消毒犀角 金线鈀鱼体20-30分钟，再用80-120ppm的MS-222麻醉犀角金线鈀；再以75 %酒精擦拭鱼 体后，取其心脏，加入PBS消毒液浸泡心脏组织；浸泡15-30分钟后，将心脏组织用PBS消 毒液清洗；2)原代培养：将通过1)获得的心脏组织剪成组织小块，并将其接种于25cm2细 胞培养瓶中，在16-20°C培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在16-20°C培养箱中 启动原代培养，每三天半量更换培养液，第6-8天细胞开始从组织块中迀移，30-40天长成 细胞单层；3)传代培养：原代心脏细胞铺满瓶底80%后开始传代，先吸出培养瓶中的原代 培养液，以含〇. 1-0. 2%的胰蛋白酶的胰酶消化法传代悬起细胞，加入传代培养液l-2ml以 中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于16-20°C培养箱中继续培养；每 4-6天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述犀角金线鈀心脏细胞系 建立成功。
[0008] 进一步地，所述PBS消毒液为含有浓度为100-300IU/ml的青霉素、浓度为 100-300μg/ml的链霉素、浓度为20-40μg/ml的硫酸链霉素以及浓度为20-40μg/ml的两 性霉素B。
[0009] 进一步地，所述的基础培养液为含有浓度为300-400μg/ml的谷氨酰胺和占总体 积的10-15%的胎牛血清的M199培养液。
[0010] 进一步地，所述的原代培养液为含有浓度为600-800μg/ml的谷氨酰胺、占总体 积的15-25%的胎牛血清、浓度为100-200IU/ml的青霉素、浓度为100-300μg/ml的链霉 素、浓度为20-40μg/ml的硫酸链霉素以及浓度为20-40μg/ml的两性霉素B的M199培养 液。
[0011] 进一步地，所述的传代培养液为含有浓度为500-600μg/ml的谷氨酰胺、占总体 积的10-20%的胎牛血清、浓度为20-40μg/ml的硫酸卡那霉素以及浓度为20-40μg/ml的 两性霉素B的M199培养液。
[0012] 进一步地，所述原代培养液、所述传代培养液和所述基础培养液的pH值为 7. 0-7. 2。
[0013] 进一步地，所述原代培养液、所述传代培养液和所述基础培养液的渗透压为 280-330m0sm/l〇
[0014] 进一步地，所述构建方法还包括如下细胞冻存与复苏的步骤：1)配制细胞冻存 液：冻存液包括M199培养液、胎牛血清和DMS0,按4 :5 :1的体积比混合，现用现配；2)细胞 冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液800-1200rpm离心6-10分钟，弃 掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1X106个/ml， 将lml细胞悬液转移至1. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80 °C放置24-48小 时，然后放入液氮中长期保存；3)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅 中快速摇晃至融化；然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量 基础培养液，800-1000rpm离心6-8分钟，除上清液；用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞 培养瓶中，16_20°C培养箱中培养，6-9天细胞即长成单层。
[0015] 本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。
[0016] 本发明的显著效果在于：
[0017] 1.本发明的构建方法操作简便易行，并且构建方法具有重复性，构建的细胞系稳 定性好。
[0018] 2.相对于用于核型分析的血液短期培养，采用本发明的构建方法获得的心脏组织 块中刚迀移出来的细胞具有活性，且细胞量大，可用于染色体分析。
[0019] 3.与鳍条细胞系相比，用本发明的构建方法获得的心脏细胞系原代培养中组织块 污染率较低，从而提高了成功率。
[0020] 4.本发明构建的犀角金线鈀心脏细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应 用于生物学特性研究，满足了对犀角金线鈀种质资源保存和理论研究及应用的需要。
[0021] 5.用本发明的构建方法获得的犀角金线鈀心脏细胞是中国洞穴鱼类的首个心脏 细胞系，为研究洞穴鱼类对洞穴环境的适应性提供了很好的素材，奠定了洞穴适应性研究 的基础。
【附图说明】
[0022] 图1是示出不同消毒方式对犀角金线鈀心脏组织块细胞迀移的影响的图。
[0023] 图2是示出不同培养液对犀角金线鈀心脏细胞生长的影响的图。
【具体实施方式】
[0024] 从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。
[0025] 实施例1
[0026] 1.制备PBS消毒液和细胞培养液
[0027] PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的浓度为100IU/ml，链霉素浓度为 100μg/ml，硫酸链霉素的浓度为40μg/ml，两性霉素B浓度为40μg/ml。
[0028] 基础培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺和胎牛血清，使谷氨酰胺的浓度为 300μg/ml，胎牛血清占总体积的15 %。
[0029] 原代培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酰胺的 浓度为600以8/1111，胎牛血清占总体积的25%，青霉素的浓度为10011]/1111，链霉素浓度为 100μg/ml，硫酸链霉素的浓度为40μg/ml，两性霉素B浓度为40μg/ml。
[0030] 传代培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酰胺的 浓度为500μg/ml，胎牛血清占总体积的20%，硫酸链霉素的浓度为20μg/ml，两性霉素B