浓度为20μg/ml。
[0031] 调节上述培养液的pH值为7. 0,渗透压为280m0sm/l，放置于4°C冰箱中保存备用。
[0032] 其中，与青链霉素不同，硫酸链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对许多革兰阴性杆 菌有较强的抗菌作用，此抗菌谱与庆大霉素相似，在犀角金线鈀的细胞培养中，经对比庆大 霉素和硫酸链霉素对细胞的影响，发现犀角金线鈀心脏细胞对硫酸链霉素更敏感（见表 1)，所以本实施例中选择将硫酸链霉素加入消毒液和培养液。另外，与青链双抗的抗菌谱相 似，硫酸卡那霉素主要作用于革兰氏阳性和阴性细菌，但犀角金线鈀心脏细胞对硫酸卡那 霉素的敏感性较高，因此，在本发明的犀角金线鈀心脏细胞的传代培养中，采用硫酸卡那霉 素代替了原代培养中的青链双抗。
[0033] 表1庆大霉素和硫酸链霉素对犀角金线鈀组织块细胞迀出的影响
[0034]
[0035] 另外，由于犀角金线鈀是洞穴鱼类，免疫力较低，因此，在犀角金线鈀的细胞培养 的各个阶段的培养液中加入了谷氨酰胺，以提高其免疫力降低组织块的污染率。
[0036] 2.原代培养
[0037] 先用50IU/1的青霉素浸泡消毒犀角金线鈀鱼体20分钟，再用80ppm的MS-222麻 醉犀角金线鈀。再以75%酒精擦拭鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏， 置于12孔板中，加入PBS消毒液浸泡心脏组织。浸泡30分钟后，将心脏组织用PBS消毒液 清洗5次，剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在16°C培养箱中倒置过夜，次 日再加入原代培养液3ml，在16°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第9天 细胞开始从组织块中迀移，40天长成细胞单层。
[0038] 其中，由于犀角金线鈀对青链双抗的耐受力较低，如果采用高双抗消毒处理，犀角 金线鈀心脏细胞组织块无法迀出细胞。因此，本实施例中仅使用50IU/L的青霉素浸泡消 毒。
[0039] 3.传代培养
[0040] 原代心脏细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下：先吸出培养瓶 中的原代培养液，加入〇. 1 %的胰蛋白酶-EDTA溶液2ml，消化3分钟，细胞变圆后，加入传 代培养液2ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按 1:2进行传代，于16°C培养箱中继续培养；每6天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换 成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至30代。
[0041] 4.细胞冻存与复苏
[0042] (a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括M199培养液、胎牛血清和DMS0,按4 :5 :1的 体积比混合，现用现配。
[0043] (b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液SOOrpm离心10 分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1X1〇6 个/ml，将lml细胞悬液转移至1. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°C放置24 小时，然后放入液氮中长期保存。
[0044] (c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化。 然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，800rpm 离心8分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，16°C培养箱中培 养，9天细胞即长成单层。
[0045] 实施例2
[0046] 1.制备PBS消毒液和细胞培养液
[0047] PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的浓度为300IU/ml，链霉素浓度为 300μg/ml，硫酸链霉素的浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml。
[0048] 基础培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺和胎牛血清，使谷氨酰胺的浓度为 400μg/ml，胎牛血清占总体积的10%。
[0049] 原代培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酰胺的 浓度为800μg/ml，胎牛血清占总体积的15%，青霉素的浓度为200IU/ml，链霉素浓度为 30μg/ml，硫酸链霉素的浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml。
[0050] 传代培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酰胺的 浓度为600μg/ml，胎牛血清占总体积的10%，硫酸链霉素的浓度为40μg/ml，两性霉素B 浓度为40μg/ml。
[0051] 调节上述培养液的pH值为7. 0,渗透压为300m0sm/l，放置于4°C冰箱中保存备用。
[0052] 2.原代培养
[0053] 先用50IU/1的青霉素浸泡消毒犀角金线鈀鱼体30分钟，再用120ppm的MS-222麻 醉犀角金线鈀。再以75%酒精擦拭鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏， 置于12孔板中，加入PBS消毒液浸泡心脏组织。浸泡15分钟后，将心脏组织用PBS消毒液 清洗3次，剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在20°C培养箱中倒置过夜，次 日再加入原代培养液5ml，在20°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第6天 细胞开始从组织块中迀移，30天长成细胞单层。
[0054] 3.传代培养
[0055] 原代心脏细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下：先吸出培养瓶 中的原代培养液，加入〇. 2 %的胰蛋白酶-EDTA溶液lml，消化2分钟，细胞变圆后，加入传 代培养液1. 5ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后 按1:2进行传代，于20°C培养箱中继续培养；每4天传代一次，传至第10代时，细胞培养液 换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至30代。
[0056] 4.细胞冻存与复苏
[0057] (a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括M199培养液、胎牛血清和DMS0,按4 :5 :1的 体积比混合，现用现配。
[0058] (b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心6 分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1X1〇6 个/ml，将lml细胞悬液转移至1. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°C放置48 小时，然后放入液氮中长期保存。
[0059] (c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化。 然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，lOOOrpm 离心6分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20°C培养箱中培 养，6天细胞即长成单层。
[0060] 实施例3
[0061]1.制备PBS消毒液和细胞培养液
[0062]PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的浓度为300IU/ml，链霉素浓度为 300μg/ml，硫酸链霉素的浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml。
[0063] 基础培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺和胎牛血清，使谷氨酰胺的浓度为 400μg/ml，胎牛血清占总体积的10 %。
[0064] 原代培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酰胺的 浓度为800μg/ml，胎牛血清占总体积的15%，青霉素的浓度为200IU/ml，链霉素浓度为 30μg/ml，硫酸链霉素的浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml。
[0065] 传代培养液：向M199培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素，使谷氨酰胺的 浓度为600μg/ml，胎牛血清占总体积的10 %，硫酸链霉素的浓度为40μg/ml，两性霉素B 浓度为40μg/ml。
[0066] 调节上述培养液的pH值为7. 0,渗透压为300m0sm/l，放置于4°C冰箱中保存备用。
[0067] 2.原代培养
[0068] 先用50IU/1的青霉素浸泡消毒犀角金线鈀鱼体25分钟，再用lOOppm的MS-222麻 醉犀角金线鈀。再以75%酒精擦拭鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏， 置于12孔板中，加入PBS消毒液浸泡心脏组织。浸泡20分钟后，将心脏组织用PBS消毒液 清洗4次，剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在18°C培养箱中倒置过夜，次 日再加入原代培养液4ml，在18°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第8天 细胞开始从组织块中迀移，35天长成细胞单层。
[0069] 3.传代培