离散的细胞培养微环境的阵列、制备该阵列的方法及其用图
【专利说明】离散的细胞培养微环境的阵列、制备该阵列的方法及其用途
[0001]本发明涉及具有影响细胞的表型和命运，即增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迀移的不同性质，即不同的机械和/或生化性质(即细胞粘附、信号转导、降解性等)的细胞培养微环境的离散体积的阵列，制备该阵列的方法，制备该阵列的组件试剂盒和测试水凝胶制剂对细胞生长行为，特别是难以培养的细胞类型，例如干细胞的影响的组合方法。
【背景技术】
[0002]多年来已知的是，将二维细胞培养系统以及天然来源的三维细胞培养系统作为模型以阐明复杂的细胞行为，尤其是在癌症或干细胞研究的领域。
[0003]二维细胞培养系统具有的缺点是不能实现与在体内发现的那些很类似的基因表达模式和细胞表型。进一步地，不能期望它们忠实地复制体内细胞培养微环境的某些关键的生理学特性，尤其是空间约束、蛋白水解重构、刚性介导(stiffness-mediated)的力学转导和配体呈递的适当模式。
[0004]天然来源的3D细胞培养系统的组成未明确确定并且显示出批次间差异，使得以系统的方法改变它们的性质并且独立地控制它们的关键基质参数是不可能的。
[0005]因此，本发明的目的是克服现有技术的缺点，尤其是提供能够快速识别控制希望的细胞行为的细胞培养和细胞培养微环境的工具和方法。
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[0007]本发明的第一个方面涉及细胞培养微环境的离散体积的阵列，所述微环境(优选地各自)具有影响包封的细胞的行为的不同性质。
[0008]如本文所理解的，术语“包封在细胞培养微环境中”或类似的表达指细胞(或多种细胞)以如下的方式被包埋在基质中:它们被所述基质完全地包围，从而模拟天然存在的细胞生长条件。
[0009]如本文所理解的，术语“微环境”或“微环境的体积”分别指适于高通量测试设备，尤其是多孔板的体积。在多孔板中被分析的典型体积的范围为约lOOnl至约500 μ 1，优选为约200nl至约20 μ Ιο
[0010]术语“离散的体积”涉及在阵列内空间上分离的点或区域。分离的点或区域可以相互接触或通过例如塑料屏障相互分离。在这些离散的体积的每一个之中或之上，希望的细胞类型的细胞可以以这样的方法放置，以使它们相互分离。它们从试验开始就不相互接触，并且随着时间保持，从而独立于邻近的体积生长并且仅仅受它们的细胞培养微环境的影响。
[0011]具体地，可以使用三维水凝胶的阵列，所述三维水凝胶具有离散的体积并且具有影响细胞的增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迀移的不同性质。使用的水凝胶通过交联水凝胶前体分子获得，优选为亲水聚合物，例如基于聚(乙二醇)(PEG)的聚合物，最优选为通过与细胞相容的交联反应交联的多臂的基于PEG的聚合物。
[0012]如本文所理解的，“通过细胞相容的反应(或多种反应)可交联的”(或类似术语)包括基于以下两者的反应:(i)共价键形成，选自a)酶催化的反应，优选其依赖于活化的谷氨酰胺转移酶因子Xllla ;以及b)非酶催化的反应和/或非催化的反应，优选为迈克尔加成反应；和/或ii)非共价键形成(例如基于疏水相互作用、Η键、范德华力或静电相互作用；特别是通过温度变化或缓冲液的离子强度的变化诱导的)。
[0013]在优选的实施方案中，选择基于PEG的前体分子，以使通过详述于2007年Ehrbar等人的交联机制在生理条件下使用凝血酶活化因子Xllla，或通过详述于2003年Lutolf等人的交联机制通过温和化学反应是可交联的。
[0014]在所述阵列的离散的体积中，水凝胶前体分子的交联在将被研究的细胞类型的存在下以这样的方式实现，将细胞通过水凝胶基质包封，即细胞处在不同的细胞培养微环境中。
[0015]在3D中，来自细胞培养微环境的各种力学和生化因子在增殖/自我更新、分化、迀移和/或集落形成方面影响细胞的行为。在根据本发明的阵列中，这些因子可以在体积与体积之间不同，并且因此能够在许多，优选为数百或数千的独特细胞培养微环境中同时研究单个因子或因子的组合对细胞类型的影响。这样，可以系统地剖析在细胞培养微环境中个体因子对细胞命运的作用，尤其是可以快速地确定控制难以培养的细胞类型，例如干细胞的行为的水凝胶细胞培养微环境。
[0016]根据本发明的三维水凝胶基质的力学性质可以通过改变细胞培养微环境的聚合物含量以及聚合物凝胶前体的分子量和/或官能度(可以用于交联的位点的数目)而变化。因此，例如由杨氏模量(E)表示的基质的刚度可以在300到5400pa之间变化。
[0017]进一步地，通过将对细胞分泌的蛋白酶例如基质金属蛋白酶(MMP)或纤溶酶具有不同敏感性(即krat/Kj的肽引入基质，赋予凝胶基质降解特性，使得基质的物化性质可以随着时间变化。当蛋白酶通过细胞分泌时，基质对蛋白酶的敏感性和所产生的物化性质的变化实现了在三维基质中高效的细胞增殖和迀移。为了匹配对蛋白质降解具有不同敏感性的水凝胶基质的力学性质，基质的前体含量可以通过改变基质的聚合物前体的含量、聚合物凝胶前体的分子量和/或官能度(可用于交联的位点的数目)进行微调。如在以下更详细概述的，在基于PEG的水凝胶基质中，对蛋白酶的敏感性可以例如通过将对细胞分泌的蛋白酶具有不同敏感性的不同肽序列引入基质前体分子而改变。
[0018]细胞培养微环境的生化性质可以通过将一种或多种生物活性分子添加到所述基质调整。如本文所使用的，这些生物活性分子可以选自，例如以下的组:
[0019]i)源于细胞外基质(ECM)的因子；
[0020]ii)细胞间相互作用因子；和/或
[0021]iii)细胞信号转导因子。
[0022]使用的源于细胞外基质的因子i)可以是，例如ECM蛋白，例如层粘连蛋白、胶原蛋白、多种弹性蛋白(elastins)、纤连蛋白或弹性蛋白(elastin)，蛋白聚糖，例如硫酸肝素或硫酸软骨素，非蛋白聚糖的多糖例如透明质酸，或基质细胞蛋白，例如蛋白质CN家族的那些、微管蛋白、骨桥蛋白、骨膜蛋白、SPARC家族成员、腱糖蛋白或血小板反应蛋白。这些ECM因子可以以全长形式或者作为更小的功能结构单元例如肽和低聚糖使用。
[0023]使用的细胞间相互作用蛋白ii)大多数为跨膜蛋白，可以是参与细胞间粘附的蛋白质，例如钙粘素、选择蛋白或属于Ig超家族(ICAM和VCAM)的细胞粘附分子(CAM)或跨膜细胞信号转导系统的组分例如S样和Jagged Notch配体。
[0024]使用的细胞信号转导因子iii)可以是生长因子或发育形态因子，例如以下家族的那些:肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(ΕΡ0)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、白血病抑制因子(LIF)、迀移刺激因子、肌肉生长抑制素(⑶F-8)、神经生长因子(NGF)和其它神经营养蛋白、血小板源性生长因子(TOGF)、血小板生成素(ΤΡ0)、转化生长因子α (TGF-α)、转化生长因子β (TGF-β)、肿瘤坏死因子a (TNF-a)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号转导通路、胎盘生长因子(P1GF)或细胞因子或趋化因子的大类的成员。
[0025]在交联之前或过程中，源于细胞外基质的因子i)和细胞间相互作用的因子ii)可以位点特异性地附着到水凝胶基质。使用生物活性分子对凝胶的官能化可以通过在生物分子上的自由官能团(例如胺基或巯基)之间直接形成共价键，或用于交联酶(例如谷氨酰胺转移酶)和凝胶网络的肽底物，或者通过嵌合/标记蛋白上的结构域和连接到所述凝胶的辅助蛋白之间的亲和结合实现。标记蛋白包括具有Fc标记、生物素标记或His标记的那些，从而能够结合到蛋白质A(或蛋白质G、蛋白质A/G)、链霉亲和素(或抗生物素蛋白)或ΝΤΑο
[0026]生物分子可能需要不同的对水凝胶网络的凝胶连接(gel-tethering)策略。较大的源自ECM或ECM模拟蛋白和肽优选通过使用线性、异源双官能连接体的非特异性连接附着到水凝胶。这样的连接体的一个官能团对连接到聚合物链末端的官能团，优选巯基有反应性。所述连接体的其它官能团能够通过其胺基非特异性连接到感兴趣的生物分子。后者的官能团选自:琥珀酰亚胺活性酯，如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、琥珀酰亚胺a-甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯；醛；硫醇；巯基选择性基团如丙烯酸酯、马来酰亚胺或乙烯砜；吡啶硫酯和吡啶二硫化物。优选地，NHS-PEG-马来酰亚胺连接体连接到生物分子。
[0027]细胞信号转导因子iii)可以在空间上分离的区域中以可溶的形式添加到包封细胞的交联的水凝胶基质，从而能够自由地扩散进入基质以到达所述细胞。供选择地，它们可以以与如上所述的用于源于细胞外基质的因子i)和细胞间相互作用因子ii)的相同方式连接到基质。
[0028]本发明的另一个方面涉及制备本文所概述的阵列的方法。具体地，所述方法包括以下步骤:
[0029]a)提供一种或多种不同的水凝胶前体分子；
[0030]b)将根据步骤a)的水凝胶前体分子的不同组合结合并分配到基底的离散的体积之上/之中，所述基材优选为多孔板；
[0031]c)向所述离散的体积添加一种或多种生物活性分子并且将所述分子连接到存在的所述水凝胶前体分子或在步骤e)形成的水凝胶中的至少一种或允许它们自由地扩散；
[0032]d)将细胞添加到所述基底的离散的体积之上/之中，和
[0033]e)将所述水凝胶前体分子交联以形成水凝胶基质。
[0034]在以上描述的方法的步骤a)中，使用的水凝胶前体分子优选为经化学或酶促反应聚合的基于PEG的前体，生物分子可以连接到其上并且其可以通过不损害细胞活力的机制交联。如果基于PEG的前体包括用于谷氨酰胺转移酶例如因子Xllla的(具有谷氨酰胺和赖氨酸的)肽底物，交联可以借助该酶实现。最优选地，前体分子还包括不同蛋白水解敏感性的肽序列以实现细胞介导的水凝胶降解，即基质随着时间在结构和力学性质上的局部变化。
[0035]以上描述的方法的步骤b)优选使用用于凝胶制造和微型化样品的自动方法实现，以实现在配制具有大量不同的细胞培养微环境的3D含细胞的基质所需的多样性水平，并且还实现所需的重复。为了这个目的，优选使用市售的液体处理机器人，以完全自动的方式将根据步骤a)的前体分子的每种独特混合物的低至100至500纳升的体积精确地合成到基底例如载玻片上，或优选的多孔板例如标准的1536多孔板中，优选一式三份。优选后一种形式，因为它提供所选的水凝胶滴的理想表面体积比并且代表了可以适用于各种实验设置的标准形式。一旦生成3D水凝胶基质，系统可以充当多模式检测平台，其中可以平行获得多个读数。
[0036]在以上描述方法的步骤c)中，生物活性分子如在上文中所概述的进行选择。
[0037]在步骤e)中，将水凝胶前体分子交联以形成三维水凝胶基质可以通过使用至少一种交联剂实现。当使用基于PEG的前体分子时，选择的交联剂是凝血酶活化因子Xllla或具有MMP-敏感底物的化学反应性双官能寡肽(详述于Lutolf等人，2003)。然而，还可以想到的是，当两种彼此之间容易反应的不同前体分子组合时，交联可能会立刻发生(例如通过高选择性的所谓的点击化学或其它化学的而不是酶催化的反应，例如迈克尔型加成反应)Ο
[0038]在之后的时间点，分配的水凝胶前体的阵列可以存储和使用(即用来接触细胞以用于筛选试验)。存储优选在多孔板(例如96-、384_或1536-孔板)中进行并且可以使用溶液中的前体(其中没有交联剂)或别的冻干前体(即粉末)实现。所述粉末是未反应的并且保持未反应状态，意味着前体的结构组分(如PEG)与交联剂几乎没有反应。在例如加入缓冲液时，将冻干前体溶解然后可以相互反应。
[0039]本发明的再另一方面涉及测试水凝胶制剂对细胞生长行为的影响的组合方法。具体地，所述组合方法包括以下步骤:
[0040]a)提供一种或多种不同的水凝胶前体分子；
[0041]b)将根据步骤a)的水凝胶前体分子的不同组合结合并分配到基底的离散的体积之上/之中，所述基底优选为多孔板；
[0042]c)向所述基底的离散的体积进一步添加一种或多种生物活性分子并且将所述分子连接到存在的水凝胶前体分子或在步骤e)形成的水凝胶中的至少一种或允许它们自由地扩散；
[0043]d)将(希望的细胞类型的)细胞添加到所述基底的离散的体积之上/之中，和
[0044]e)将所述水凝胶前体分子交联以形成水凝胶基质；
[0045]f)使所述细胞在所述水凝胶基质的所述离散的体积中生长(并改变它们的行为)；
[0046]g)在步骤f)过程中，随时间推移监测所述细胞；
[0047]h)针对不同的细胞培养微环境测定行为，其中所述行为优选地选自:增殖程度、集落形成、分化、迀移或其组合，优选地针对不同细胞培养微环境的全部阵列测定行为；
[0048]i)任选地，测定在生物活性分子和/或力学性质彼此之间的协同和/或拮抗作用和/或所述离散的细胞培养微环境对于酶降解的敏感性，优选地通过蛋白酶测定；
[0049]j)任选地，确定指示特定细胞行为的具体水凝胶制剂，或水凝胶制剂的范围；
[0050]k)任选地，将细胞从至少一种水凝胶细胞培养微环境中分离用于进一步分析，优选为表型检测，或用于连续的细胞培养或传代。
[0051]在步骤a)中使用的不同水凝胶前体分子优选地如本文别处所概述的进行选择。
[0052]上述的组合方法的步骤b)优选使用在本文别处所概述的自动方法进行。
[0053]在上述的组合方法的步骤c)中，提到的所述生物活性分子可以如本文别处所概述的进行选择。
[0054]在步骤e)中，在步骤a中提供的所述水凝胶前体分子的交联可以如本文别处所述的实现。
[0055]在组合方法步骤f)中，所述细胞能够在水凝胶基质的离散的体积中增殖/自我更新、形成集落、分化和/或迀移，优选持续数天直至数周。
[0056]在组合方法步骤g)中，细胞行为的监测可以以固定的时间间隔进行，例如在某些天数之后，并重复。监测例如使用自动成像技术，常规的或共聚焦镜检进行，并且可以包括实时成像。
[0057]在组合方法步骤h)中，不同细胞培养微环境的增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迀移行为的测定，例如可以如下实现:使用宽视野显微技术或使用细胞表达荧光标记，如绿色荧光蛋白(GFP)