作用分析获取。类似地，不可降解的条件也呈现这样的非线性效应，但Ecad条件在高度降解条件的存在下具有正影响(参见图5d)。同样，ECad在一种更硬的条件具有更明显的正效应(参见图5e)。
[0117]筛选的条件为理解神经上皮的形态和极性的机理提供基础
[0118]高通量筛选，例如这里提出的可以作为用于更有针对性的研究的假说工具。例如，通过因子相互作用分析确定的假定的FGF4的非线性效果显示为细胞密度介导的:在相对高的细胞密度(3百万个细胞/ml)下，向培养基添加FGF4几乎没有效果，而在较低的细胞密度(1百万个细胞/ml)下，缺乏FGF4导致增殖和GFP强度减少(参见图6a)，突出了这种生长因子作为神经分化的自分泌调节剂的作用。
[0119]来自这样的筛选的图像集的分析还输出超出作为增殖量度的平均集落面积和作为分化量度的Soxl-GFP表达的额外度量，其中特别相关的形态学度量与观察到的表型相关联以输入细胞培养微环境。通过使用聚类方法将多维输出组合成关联的形态学、增殖和分化的簇(未示出)，可以构造表型信号，其提供细胞行为的更全面的图像。因此，可以确定以平滑、圆形为特点的集落几乎仅在不可降解的条件下生成，而维持高GFP表达，但具有大量奇怪的和星形形状的集落在可降解基质中存在(参见图6b)。在进一步的实验中(未示出)使用宽频MMP抑制剂，可以确定这种现象确实是蛋白酶介导的。因此，通过将感兴趣的度量扩大到包括形态特征，能够确定诱导不同形态的特定微环境条件，其可能与特定形态发生通路关联。
[0120]神经囊肿形成的一个标志是内腔的发育。共聚焦3D重建清楚地示出，集落确实很好地贯穿凝胶的厚度分布，并且没有表现出特别的平面偏置(参见图6b)。在不可降解的凝胶的3D结构中的集落紧密靠近生长而没有融合，但是彼此之间保持薄的水凝胶边界(参见图6b)，表明在这样的基质中的生长通过对基质向外的力完成，并且没有通过任何重塑过程。最显著地，在以不可降解基质和FGF4为特征的选择的条件中观察到顶-底极性(apico-basal polarity)的测量值(参见图6c)和可能的退化的开始。进一步的实验显示，虽然在单一 ECM因子存在的条件中仅证实了不频繁的囊肿极性，但是当所有三种ECM组分(层粘连蛋白，IV型胶原蛋白和纤连蛋白)均引入基质中时，建立了稳健的和频繁的极性(参见图6d) ο
[0121]在该高通量方法中，在3D细胞培养微环境的阵列中的ESC的响应形成了对神经上皮分化调节的新见解。正如在ESC自我更新的研究中，可溶性因子发挥了主导作用，特别是在测定增殖中，并且在促进或阻碍分化中具有明显的效果。基质的影响，特别是基质MMP敏感性，在指定细胞命运中起同样显著的作用。事实上，球形上皮集落仅在不可降解基质中观察到，而在可降解基质中，分化的程度和集落形态显著改变。此外，参与细胞间相互作用的蛋白损害神经上皮分化，而ECM蛋白对建立只有以组合方式呈现的顶-底极性起重要作用。因此，高通量平台，如在这里使用的，不仅被视作理解细胞培养微环境对发育途径影响的工具，还可以作为可以使得更复杂的机制被阐明的巨大的假说方法。
[0122]阵列平台适合多种检测和细胞类型
[0123]本发明的另外的实施方案包括进行迀移和形态检测的可能性。此外，这种检测可以从单一细胞(如先前看到的)或从体外形成的细胞团(如胚体)或直接从活组织分离的细胞团开始进行。作为实例，将间充质干细胞聚集到300个细胞的尺寸，引入组合的细胞培养微环境，并在16小时后评估它们的迀移(在培养基中存在作为可溶性因子的TOGF)。基质-连接ECM-模拟肽(源于纤粘连蛋白的RGD基序)，以及基质MMP敏感性调节从簇向外的细胞迀移响应(参见图7a)。可以将各种上皮细胞簇，包括例如胰腺的，子宫内膜的，肠的或乳腺的，引入筛选平台，并评估干细胞标志物，极性或其它形态特性(参见图7b)。
[0124]实验细节
[0125]水凝胶前体合成
[0126]制备PEG乙烯砜(PEG-VS)，其性质如别处所描述(Lutolf和Hubbell, 2003)。在第二步中，使用因子Xllla-肽底物通过迈克尔加成将PEG-VS官能化。使用含有谷氨酰胺的肽(NQEQVSPL-ERCG-NH2)和具有各种MMP敏感性序列的不同类型的含有赖氨酸的肽:
[0127]AcFKGG-GPQGIWGQ-ERCG-NH2 (肽 W)，
[0128]AcFKGG-GDQGIAGF-ERCG-NH2 (肽 A)，
[0129]AcFKGG-PQGIAGQ-ERCG-NH2 (肽 G)，
[0130]AcFKGG-VPMSMRGG-ERCG-NH2 (肽 V)。因此，得到一种谷氨酰胺-PEG前体(Q-PEG)和四种不同的赖氨酸-PEG前体:W-PEG、A-PEG、V-PEG、G-PEG。如在别处(Ehrbar等人，2007)所描述的进行这些前体的官能化和表征。简言之，在37°C下，在0.3M三乙醇胺(pH 8.0)中，将肽以超过VS基团1.2倍的摩尔过量加入到PEG-VS中2小时，然后在4°C下，用超纯水透析(Snake Skin, MWCO 10k, PIERCE) 4 天。透析后，将无盐产品(Q-PEG、W-PEG、A-PEG、V-PEG, G-PEG)冻干，得到白色的粉末。
[0131]水凝胶制备
[0132]在水中将因子XIII (Fibrogammin P, CSL Behring)从冻干粉复溶到浓度为200U/ml ο 在 37 °C 下，使用 100 yL 的凝血酉每(20U/mL, Sigma-Aldrich, Switzerland)将lml因子Xllla活化30分钟。将等份的已活化的因子Xllla储存在_80°C下用于进一步使用。通过Q-PEG的化学计量平衡([Lys]/[Gln] = 1)溶液制备最终干质量含量为
1.5到4%的水凝胶的前体溶液，并且四种赖氨酸-PEG中的每种均在含有50mM氯化钙的Tris-Buffer (TBS, 50mM, pH7.6)中。交联反应通过10U/mL凝血酶活化的因子Xllla和剧烈混合引发。为了得到盘形基质，液体反应混合物(50 μ 1)被夹在被垫片(厚度约1_)分开的无菌疏水性显微载玻片(通过使用SigmaCote，Sigma处理得到的)之间并且使用长尾夹夹紧。然后将基质在37°C下孵育30min。
[0133]MMP-介导的降解的表征
[0134]针对4条肽序列中的每条制备PEG为3.5% w/v的三个50 μ 1凝胶盘，并使之pH7.5的50mm TrisUOOmM NaClUOmM CaCl2缓冲液中溶胀12小时。然后将它们称重并放到40mM MMP-1溶液中，在相同的缓冲液中溶解。在最初的12小时内，间隔2小时记录凝胶质量，然后在t = 18、24、48和72时记录。完成降解的时间直接或通过线性回归(针对G肽)确定，然后转化得到降解性的量度。
[0135]力学性质的表征
[0136]使凝胶盘(对于每个MMP敏感性η = 3)在缓冲液中溶胀12小时，然后进行小型应变振荡剪切流变测定。将1至1.4mm厚的溶胀的水凝胶盘夹在Bohlin CV 120(BohlinInstruments)流变仪的两个板之间，并压缩到它们的初始厚度的85%至75%以避免滑动。然后在恒定应变(5% )模式下进行测量。在0.1至1Hz的频率范围内记录剪切应力，并得到超过所述频率范围的平均存储模量(G’)。将存储模量(G’)作为针对4种MMP-敏感性的每个的水凝胶％ PEG w/v的函数绘图。对所述G’相对于％ PEG数据点采用线性内插法。对于每种降解性，测定对应于0、600、1200和1800Pa的％ PEG。
[0137]使用细胞间相互作用蛋白修饰基质
[0138]为了将细胞间相互作用蛋白结合到水凝胶网络，使用了 Fc-标记/蛋白A结合策略。为了使蛋白A对于因子Xllla催化的交联具有敏感性，使用NHS-PEG-马来酰亚胺，一种异源双官能连接体，将含Q肽连接到蛋白A。蛋白A的修饰在两步反应中实现:通过10倍摩尔过量的NHS-PEG-马来酰亚胺的反应用马来酰亚胺基团官能化，然后是通过其半胱氨酸侧链的Q肽连接。因此，Q蛋白A官能化通过SDS-PAGE定性评估。选择用于因子Xllla的荧光计数反应底物，含有赖氨酸的探针，Lys-Tamra用于检测因子Xllla介导的交联反应是否能够发生。当蛋白A和Lys-Tamra在因子Xllla的存在下混合时，在SDS-PAGE和胶内荧光扫描中将检测到与蛋白A相对应的荧光信号，证实了成功的生物结合。为了实现细胞间相互作用蛋白与基于因子Xllla的水凝胶的共价连接，在室温下，将Fc标记的钙粘素、EpCAM和Jagged(R&D Systems)与Q蛋白A以1.66摩尔过量比率预混合30分钟。考虑到蛋白A具有五个Fc结合位点的事实，我们提供了相对于Fc-蛋白3倍分子过量的每种Fc结合位点，这应该确保成型素的最佳固定化。将得到的完全官能化的蛋白质构建体的溶液等分并在_20°C下贮存直到进一步使用。
[0139]测定ECM蛋白对因子Xllla介导的交联的敏感性
[0140]基于大型ECM蛋白可能是因子Xllla的天然底物并且可以连接(tether to)到水凝胶网络而不用进一步结合的假设，在溶液中使用以下感兴趣的ECM蛋白:层粘连蛋白、I型胶原蛋白(BD B1sciences)、纤连蛋白(R&D Systems)。进行焚光结合试验，其中在因子Xllla的存在下，蛋白质与每种荧光因子Xllla底物(Q-肽_Alexa647或赖氨酸-Tamra)混合。反应通过SDS-PAGE以及胶内荧光扫描定性分析，证明了蛋白对于基于因子Xllla的交联确实是敏感的。所有的ECM蛋白在4°C下等分并在_20°C下储存。
[0141]细胞培养
[0142]在所有的ESC自我更新试验中，0ct4_GFP鼠胚胎干细胞(mESC)(由Zandstralab提供的R1系)在明胶涂覆的培养皿上在含有15 %的血清(Hyclone)和106U/mlLIF(Millipore)的培养基中常规培养。在进行试验之前十二小时，将培养基更换为不含血清的knock-out培养基(K0)。
[0143]在所有的神经上皮分化实验中，Soxl-GFP鼠胚胎干细胞(由Tanaka实验室提供的46C细胞系)在含有15%的血清(Hyclone)和106U/ml LIF (Millipore)的培养基中常规培养。在实验之前，对细胞进行胰蛋白酶处理并重悬在缺乏任何诱导信号的神经分化培养基中。N2/B27制剂型在别处有报道(Ying，2003)。
[0144]在所有的间充质干细胞迀移实验中，来自人体胎盘的原代多能间充质干细胞(在传代8次时使用的细胞，由Ehrbar实验室提供)在含有15%血清(Invitrogen)的培养基中常规培养。使用Aggrewell板(STEMCELL Technolog SARL)生成各具有250个细胞的细胞团，然后收获所述细胞团并用于凝胶封装试验。在检测中，为了刺激迀移，在基础培养基中添加 50ng/ml PDGF (Peprotech)。
[0145]如在别处(Debnath，2003)所描述的，采用乳腺上皮细胞的实验使用MCF10A细胞系进行，所述MCF10A细胞系在生长培养基中常规培养并分化。如别处(Jin，2013;Schatz, 2000 ；Li, 2012 ;分别为胰腺的、子宫内膜的、肠的)所概述的，使用标准技术和试剂分离并分化原代上皮细胞团。
[0146]存活率检测
[0147]进行存活率检测以比较在2D和3D条件下的细胞行为。使野生型mESC经胰蛋白酶处理并以1M细胞/ml接种到明胶涂覆的组织培养皿(2D)或包封到在600pa不降解(A)的水凝胶皿(3D)中。在+LIF无血清的条件下，在37°C ,5% C02下孵育4小时，然后根据制造商的说明，使用活/死细胞存活率检测进行染色。对三种独立的样品进行常规(2D)或共聚焦(3D)荧光成像，然后人工计数活(绿色)与死(红色)细胞的比例。
[0148]机械混合和分配
[0149]为了实现该方法的组合复杂度，使用具有纳米移液器头的Hamilton MicrolabStarPlus自动液体处理机器人。所有的自动化步骤使用4.1.1版MicroLab Vector软件(HAMILTON Bonaduz AG, Switzerland)程序化。通过将谷氨酰胺-PEG 前体(Q-PEG)与四种不同的赖氨酸-PEG前体:W-PEG、A-PEG, V-PEG、G-PEG混合，制备与四种肽相对应的预混合的化学计量平衡的PEG溶液的储备液。这四种储备液各自稀释到实现匹配的目标刚度所需的流变学确定的四种相应浓度。稀释和过程的所有随后的步骤由机器人进行，优化用于每种材料类别的流体处理参数并通过在天平上进行质量测量来检查(数据未示出)。重要的，使最终的总体积的30%是空的(备用体积)用于随后添加蛋白、细胞和因子Xllla(每种组分为总体积的10% )。将这16种组合等分到384-孔板的256个孔中。将EC和CC蛋白在冰上解冻，稀释到500nM的浓度并置于冷却的384孔板的孔中。以正交的方式将四种EC蛋白(包括空白对照)分配到256个充满凝胶前体的孔中，然后是四种CC蛋白，以在该步骤的最后获得MP、DG、EC和CC的256个独特的组合(4x4x4x4)。使用含以下三种可溶性因子和空白对照的培养基制备96孔板:10ng/ml的FGF4、BMP4 (R&D Systems)和106U/ml的LIF (Mi 11 ipore) ο将细胞经胰蛋白酶处理并以lx 106个细胞/ml的浓度重悬在无血清的培养基中并保持在冰上。同时将冰冻的等份的因子Xllla解冻并也保持在冰上。然后以顺序的方式将细胞分配到混合凝胶前体的八个孔中，然后将因子Xllla迅速分配并经机器人混合。在添加因子Xllla后，并且在胶凝开始之前(大约2-3分钟)，紧接着使用八通道纳米移液器从每个孔中吸12.5 μ 1并在1536孔板的12个孔中分配1 μ 1。该过程重复共八次/1536板(12χ 8通道X 8次χ12滴/ (通道.次)=768滴)以充满1536孔板的一半。在整个过程中，1536孔板冷却至4°C以阻止蒸发。在凝胶分配轮次的最后，将96孔板中的4种不同的培养基分配到1536实验板中。培养基的分配步骤也顺序进行并同步，从而使所有的凝胶交联约30分钟。从胰蛋白酶处理到完成培养基分配的整个过程耗费两个小时，并且整个实验进行了四次(4x 4个二分之一板的1536个孔=3072个孔)。
[0150]对于神经上皮分化实验，在第一阵列中使用除了细胞间相互作用蛋白以外的所有其它组合进行可溶性因子调节。在第二阵列中，所有的细胞间相互作用蛋白针对除了可溶性因子以外的所有其它条件测试，其被