治疗心肌病的基因治疗载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗或预防对其有需要的主 体的肥厚型心肌病。本发明的基因治疗载体包括编码心脏肌节蛋白的核酸序列和与所述核 酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子。本发明还涉及一种包含上述基因治疗载体 的细胞。本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包括上述基因治疗载体和/或含上述 载体的细胞。另一方面，本发明涉及一种通过将本发明的基因治疗载体引入需要治疗的主 体体内，来治疗或预防主体的肥厚型心肌病的方法。
【背景技术】
[0002] 虽然在由环境因素（诸如尼古丁、高胆固醇血症或糖尿病）引起的心脏疾病的预 防以及在心脏病症的对症治疗中取得了相当大的进展，但仍然需要能改善对遗传性心肌病 的治疗的方法。遗传因素造成的心肌病是肥厚型心肌病（HCM)、扩张型心肌病（DCM)和致心 律失常型右室心肌病（ARVC)。
[0003] HCM是最普遍的心肌病，其特征是，在没有另一心脏病或全身性疾病（自身能在给 定患者中明显产生一定程度的肥厚）的情况下，原因不明地出现左心室肥厚。HCM与收缩 最初正常，但舒张功能受损相关（Elliott et al·，2008, Eur Heart J 29:270-276 ;Gersch et al·，2011，J Thorac Cardiovasc Surg 142:el53-203) C3HCM具有特别高的患病率，在普 通人群中的患病率约为 1:500 (Maron et al·，1995, Circulation 92:785-789)，并且是导 致年轻人，尤其是运动员发生突发心脏死亡的首要原因。虽然HCM是一种危及生命的疾病， 但迄今为止还不能进行治愈性治疗（Carrier et al·，2010, Cardiovasc Res 85:330-338; Schlossarek et al·，2011，J Mol Cell Cardiol 50:613-20)。
[0004] HCM是一种常染色体的显性疾病，已知由至少10种编码心脏肌节组分的基因的 多于1000种不同的突变引起，其中该至少10种编码心脏肌节组分的基因编码诸如，心脏 肌球蛋白结合蛋白C (MYBPC3)、β -肌球蛋白重链（MYH7)、心肌肌钙蛋白T (TNNT2)、心肌肌 钙蛋白I (ΤΝΝΙ3)、室性肌球蛋白必需轻链I (MYL3)、室性肌球蛋白调节轻链2 (MYL2)、心脏 α-肌动蛋白（ACTC)、α-原肌球蛋白（TPM1)、肌联蛋白（TTN)、四加半LIM蛋白I(FHLl) (Richard et al.,2003,Circulation 107:2227-2232 ；Schlossarek et al.,2011,J Mol Cell Cardiol 50:613-20 !Friedrich et al·, 2012, Hum Mol Genet 21:3237-54)。大多数 突变是编码全长的突变多肽的错义突变。众所周知的例外是MYBPC3和FHL1，它们主要表现 为产生C-端截短的蛋白的移码突变。
[0005] HCM中最常发生突变的基因是编码心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)的 MYBPC3(Bonne et al.,1995,Nature Genet II:438-440 ；ffatkins et al.,N Engl J Med.，2011，364:1643 - 56)。cMyBP-C是肌节A带的主要成分，它在肌节A带中与肌球 蛋白、肌动蛋白和肌联蛋白相互作用（Schlossarek et al·，2011，J Mol Cell Cardiol 50:613-20)。在人和小鼠中，仅在心脏中检测到（Fougerousse et al, 1998, Circ Res 82:130-133)，并且 cMyBP-C 参与调节心肌的收缩和舒张 （Pohlmann et al.，2007, Circ Res Circ Res 101，928-38 ;Schlossarek et al·，2011，J Mol Cell Cardiol 50:613-20)。 MYBPC3基因中约70 %的突变会导致移码，从而产生C-端截短的蛋白（Carrier et al.，1997，Circ Res 80:427-434)。截短的蛋白是不稳定的，而且从来没有在患者 的心肌组织中检测到（Marston et al.，2009，Circ Res 105:219-222 ;van Dijk et al.,2009,Circulation 119:1473-1483 ；van Dijk et al.,2012,Circ Heart Fail 5:36-46)。
[0006] 因此，cMyBP-C蛋白水平降低是，单倍不足（haploinsufficiency)可能是HCM的 致病机理的一种论据。全长CMyBP-C的量不足可能会使粗肌丝成分的化学计量不平衡，并 且改变肌节的结构和功能。在携带错义突变或移码突变的HCM的小鼠和猫模型中也涉及单 倍不足（Meurs et al.，2005，Hum Mol Genet 14:3587-3593 ;Vignier et al.，2009，Circ Res 105:239-248)。此外，在猫和小鼠中，有证据表明存在cMyBP-C突变体（全长或截短的） (即使为低水平的）。因此，第二种可能的致病机理是，产生诱导显性负性作用的毒性多肽， 这很可能是通过与野生型（WT)基因产物进行竞争来实现的。
[0007] 目前HCM的药物类治疗仅仅是经验性的，能缓解症状但不能治疗引起致病的遗传 原因。显然，基因类或RNA类治疗将是HCM的唯一根治性治疗。已经在与非遗传性心脏病相 关的疾病中成功测试了基因治疗方法（Jessup et al.，2011，Circulation 124:304-313)。
[0008] 申请 US 2005/0276804 和 2007/0292438 公开了 cMyBP-C 与遗传性心脏疾病 有关。然而，US 2005/0276804提出降低视黄醇结合蛋白或视黄醇来治疗这些疾病。US 2007/0292438则局限于公开在多种基因中具有破裂的不同的小鼠模型。
[0009] 申请 US 2004/0086876 和 US 2002/0127548 公开了对与 HCM 相关的人 MYBPC3 基 因中突变的诊断。此外，这些申请提出通过将编码非突变的cMyBP-C的核酸给药到患者来 治疗HCM。
[0010] Merkulov等人（2012, Circ Heart Fail, 5:635-644)公开了将小鼠 Mybpc3基因转 移到cMyBP-C-缺陷型（cMyBP-C 0小鼠的心肌中。作者认为cMyBP-C的缺失导致功能障 碍和肥厚。基因转移改善了收缩和舒张的收缩性功能，并使cMyBP-C-缺陷型（cMyBP-C /) 小鼠的左心室壁的厚度减小。
[0011] Vignier 等人（2009, Circ Res 105:239-248)开发 了携带 G>A 点突变的 Mybpc3-靶向敲入（KI)的小鼠模型，这产生了源自异常基因转录和剪接的不同的突变的 mRNA和蛋白。该文件表明，外源性应激，诸如肾上腺素应激或衰老，导致KI小鼠中的泛 素-蛋白酶体系统（UPS)饱和并最终出现损伤，潜在地随后积累cMyBP-C的突变多肽。
[0012] 本发明人发现，在由于异等位基因的突变以显性负性方式作用于编码心脏肌节蛋 白的基因而患有HCM的主体中，引入提供相应的非突变基因的基因转移载体，不仅恢复了 肌节蛋白的正常水平，而且使毒性突变多肽的有害影响最小化，否则会通过突变体等位基 因的转录产生毒性突变体多肽。
[0013] 在心肌细胞特异性启动子的控制下，外源性野生型（WT)基因的载体诱导表达克 服了携带突变的MYBPC3等位基因的主体中的突变蛋白的显性负性作用而且是没有毒性 的，因为通过基因治疗载体表达正常等位基因出人意料地有效降低了内源性突变等位基因 的表达。由于对动态平衡以及肌节蛋白更新（turnover)进行的严密的细胞内调控，这一效 果被认为是心脏细胞自主现象（cardiac cell-autonomous phenomenon)的结果。
【发明内容】
[0014] 本发明涉及用于治疗或预防HCM的新的治疗方法。已知，编码心脏肌节蛋白的许 多基因的突变导致功能性全长肌节蛋白的水平降低。这是由于移码突变引起的，其中移码 突变产生正常被泛素-蛋白酶体系统（UPS)降解的截短突变多肽。然而，在外源性应激条 件下，UPS的功能可能会受到干扰，从而积累突变多肽，突变多肽因此可并入到肌节中，并 且对野生型cMyBP-C起到显性负性的毒性肽的作用，促使HCM发病（Vignier等人，2009， 见上文）。对四加半LIM蛋白1也进行了相似的观察（Friedrich et al.，2012, Hum Mol Genet 21:3237-3254)。不产生任何cMyBP-C突变多肽的Mybpc3靶向敲除，在相同条件下 没有显不出对UPS 的任何损害（Schlossarek et al·，2012, Basic Res Cardiol 107:1-13; Schlossarek et al·，2012,J Muscle Res Cell Motil 33:5-15)。
[0015] 本文中示出，通过基因治疗载体，将编码功能性心脏肌节蛋白（诸如cMyBP-C)的 野生型cDNA基因转移到在该心脏肌节蛋白的基因中携带突变的主体中，不仅恢复了心肌 (即，由心肌细胞构成的心脏的肌肉组织）中蛋白的正常水平，而且还防止产生毒性mRNA和 /或毒性多肽，否则将通过所述主体的基因组中，编码心脏肌节蛋白的突变等位基因的表达 而产生毒性mRNA和/或毒性多肽。还观察到，引入大量的基因治疗载体与待治疗的患者的 高风险无关，因为在细胞内未发现过量的外源性野生型（WT)蛋白。出乎意料地是，心脏肌 节蛋白的表达似乎在细胞中受到化学计量地严格调控，这意味着不能以对患者有害的量提 供外源性蛋白。因此，本发明提供了一种用于治疗主体的HCM的简单且安全的方法。
[0016] 提供充足水平的正常cDNA，以充分产生心脏肌节蛋白并且抑制毒性mRNA/多肽的 组合作用，能有效治疗HCM。在不希望受到理论束缚的情况下，认为基因治疗载体进行的外 源性基因表达，通过竞争肌节特异性转录因子来降低突变等位基因的内源性表达。
[0017] 在第一方面，本发明提供了一种表达外源性核酸序列的基因治疗载体，该基因治 疗载体包括：
[0018] (a)编码功能性心脏肌节蛋白的核酸序列，以及
[0019] (b)与所述核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子。
[0020] 上述基因治疗载体适用于治疗或预防需要治疗的哺乳动物主体，优选人主体的 HCM。需要治疗的主体是在编码心脏肌节蛋白的相应基因中携带促使发生HCM的突变的主 体。在给药到待治疗的主体后，上述载体在主体，优选在所述主体的心肌中表达所编码的心 脏肌节蛋白。
[0021] 要在主体中表达的心脏肌节蛋白已知与HCM有关，即，在编码心脏肌节蛋白的基 因携带突变，这导致表达非功能性蛋白变体，例如全长或截短的变体或突变体，并最终引起 HCM。迄今为止，已知在编码心脏肌节蛋白的至少10种不同基因中的突变会引起HCM。肌节 是肌肉的基本单位，并且被定义为两个相邻Z盘之间的一段。根据本发明，待基因治疗载体 表达的肌节蛋白是心脏肌节蛋白，这意味着该蛋白天然存在于心肌的肌节中。
[0022] 要在主体中表达的心脏肌节蛋白可以是存在于心脏肌节中的结构蛋白或调节蛋 白。该蛋白优选选自由β-肌球蛋白重链（由基因 MYH7编码，RefSeqGene NG_007884.1)、 室性肌球蛋白必需轻链1 (由基因 MYL3编码，RefSeqGene NG_007555. 2)、室性肌球蛋白 调节轻链2(由基因 MYL2编码，RefSeqGene NG_007554. 1)、心脏α -肌动蛋白（由基因 ACTCl 编码，RefSeqGene NG_007553. I)、α -原肌球蛋白（由基因 TPMl 编码，RefSeqGene NG_007557. 1)、心肌肌钙蛋白 T(由基因 TNNT2 编码，RefSeqGene NG_007556. 1)、心肌肌 钙蛋白1(由基因 TNNI3编码，RefSeqGene NG_007866. 2)、心脏肌球蛋白结合蛋白C(由 基因 MYBPC3 编码，RefSeqGene NG_007667. 1)、肌联蛋白（由基因 TTN 编码，RefSeqGene NG_011618. 1)和四加半 UM 蛋白 1 (由基因 FHLl 编码，RefSeqGene NG_015895. 1)组成的 组（Richard et al·，2003,Circulation 107:2227-2232 ;Friedrich et al·，2012,Hum Mol Genet, 21:3237-54)〇
[0023] 优选地，待本发明的基因治疗载体表达的心脏肌节蛋白是心脏肌球蛋白结合蛋白 C(cMyBP-C)。该蛋白来自不同的物种，诸如小鼠、猫、猪或猴。在本发明的一个优选实施方 式中，待表达的cMyBP-C蛋白是小鼠 cMyBP-C，优选是具有所附序列表中SEQ ID N0:4(NCBI 登录号：NP_032679. 2)所不的氣基酸序列或者与其具有至少80%序列同一性的序列的小 鼠 cMyBP-C。编码SEQ ID NO: 4的小鼠 cMyBP-C的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 3 (NCBI登录 号：ΝΜ_008653· 2)中。
[0024] 本发明特别设想治疗患有HCM的人患者。因此，在本发明的另一优选实施方式中， 插入载体中的编码人cMyBP-C蛋白的核酸是人来源的。优选地，人cMyBP-C蛋白具有SEQ ID NO: 2 (NCBI登录号：ΝΡ_000247. 2)所示的氨基酸序列或具有与其至少80%序列同一性 的序列。编码人cMyBP-C蛋白的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 1(ΝΜ_000256. 2)中。
[0025] 待表达的蛋白也可以是上述蛋白之一的功能性变体，它与原始蛋白相比表现出 显著的氨基酸序列同一性。优选地，氨基酸同一性达到至少60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。优选地，该变体的氨基酸同一性为至少70%、 80%或90%。在上下文中，术语"功能性变体"指肌节蛋白的变体能实现天然存在的心脏肌 节蛋白的功能，例如，提供结构支撑/功能支撑。
[0026] 心脏肌节蛋白的功能性变体可包括，例如，通过取代、缺失或添加一个或多个氨基 酸而与其天然存在的对应体不同的蛋白。例如，相