uez et al.，2011，Hum Mol Genet 20:681-693)，使 用 30-G 针进行颞脉注射（Sands and Barker, 1999, Lab Anim Sci, 49:328-330)，将 AAV9-FLAG-Mybpc3 (5 X IO12个载体基因组（vg))或PBS (作为对照）给药到3日龄小鼠 中。所有小鼠在注射后迅速恢复。通过超声心动描记术（见实施例1中的详细说明），从 3周龄开始每周进行心脏表型的评估。杀死7周龄的小鼠并提取不同器官。提取RNA和蛋 白。通过如实施例3中描述的RT-PCR，评估心室、肝脏和骨骼肌中的FLAG-Mybpc3mRNA和总 Mybpc3mRNA (图 5A)。
[0110] FLAG-Mybpc3mRNA在心室中的水平比在其它器官中高得多（图5A，FLAG-Mybpc3 上图）。在心室中，在对照KI小鼠中扩增出不同的突变体Mybpc3mRNA(图5A，总Mybpc3下 图），而在野生型对照小鼠和用AAV9-FLAG-Mybpc3转导的KI小鼠中检测到主要的单一条带 (图5A，总Mybpc3图）。在FLAG-Mybpc3基因转移后，在肝脏和骨骼肌中也检测到条带，但 比心室中的水平低。
[0111] 使用针对CMyBP-C的抗体以如实施例3中所述的方式进行Western印迹分析，并 且揭示了：在AAV9-FLAG-Mybpc3基因转移后，cMyBP-C蛋白水平比注射PBS或AAV9-GFP的 KI小鼠高，并且达到WT小鼠中发现的水平（图5B)。由于载体的心脏特异性，在Mybpc3基 因转移后，在肝脏和骨骼肌中未检测到cMyBP-C蛋白（图5B)。
[0112] 为了检查外源性表达的带FLAG标签的cMyBP-C蛋白的定位，使用针对FLAG表位 和总cMyBP-C蛋白的抗体，对注射AAV9-FLAG-Mybpc3达7周的KI小鼠的心室冷冻切片进 行免疫荧光分析。该染色显示出，cMyBP-C蛋白的经典条纹图案位于肌节A带的二联管中 (图5C ;cMyBP-C)，并且与FLAG信号完全共染色（图5C ;FLAG)。用DRAQ5?对细胞核进行 染色。总之，过表达的cMyBP-C蛋白被正确地并入肌节内，并且大部分FLAG阳性的横纹心 肌细胞与总cMyBP-C蛋白共染色，这表明外源性cMyBP-C蛋白取代了内源性cMyBP-C蛋白 突变体。
[0113] 如在上述实施例1中所述，进行超声心动描记术分析。在3、5、6和7周龄的野生 型（WT)、注射PBS的敲入（KI-)小鼠和注射AAV9-FLAG-Mybpc3(KI+)的KI小鼠中，测定面 积短轴缩短率（FAS)以及左心室质量与体重（LVM/BW)的比率。通过超声心动描记术对心 脏功能的评估示出，在FLAG-Mybpc3基因转移后，面积短轴缩短率（FAS)得到补救并且左心 室质量与体重（LVM/BW)的比率降低（图OT)。
[0114] 总之，这些数据表明，在新生KI小鼠中AAV9-FLAG-Mybpc3的单一给药补救了分子 表型（没有cMyBP-C单倍不足也没有突变体多肽）和功能表型（没有左心室肥厚和功能障 碍）。
[0115] 实施例6:在源自诱导多能干细朐的人心肌细朐中，外源件野牛姻myc-MYBPC3的 表达。
[0116] 通过对来自人对照个体的皮肤活检扩增的成纤维细胞进行重编程，来生成诱导多 能干细胞（iPSC)。根据Gordon Keller组的方案（Yang L et al·，2008, Nature 22:524-8)， 对心肌细胞分化进行了适应性改变。
[0117] 在分化后，将人心肌细胞以2X IO5个细胞/孔的密度铺在12孔板中，用于RNA和 蛋白分析，或者以2. 5X IO4个细胞/室的密度铺在四室平皿（35_直径）中，用于免疫荧 光分析。用编码人myc-cMyBP-C(DNA序列：SEQ ID N0:29接着SEQ ID N0:1)的带myc标 签的MYBPC3腺病毒，以不同的MOI对心肌细胞进行转导，保持8天。
[0118] 带myc标签的人MYBPC3质粒的构建如前所述（Flavigny J et al.，1999, J Mol Biol 294, 443-456 ;Sarikas et al·，2005, Cardiovasc Res 66:33 - 44)。简要地说，将 ATG加编码myc表位（SEQ ID NO: 30)的30个核苷酸的序列（SEQ ID NO: 29)插入在CMV启 动子（SEQ ID N0:31)的后面并且在人MYBPC3cDNA(SEQ ID N0:1)的前面。插入序列编码 带myc标签的人cMyBP-C (SEQ ID NO: 32)。如前所述，通过将插入序列（带myc标签的人 MYBPC3cDNA)克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中，随后将该质粒与pAdEasy-Ι共转化大肠杆 菌，以产生重组腺病毒（他了6七&1.，1998?1〇。恥七1八。3(13(^1]3八95,2509-2514)。通 过组成型活性的CMV启动子（SEQ ID NO:31)驱动cMyBP-C的表达。
[0119] 如前所述，通过RT-PCR，评估在人心肌细胞中不同MYBPC3mRNA (外源性 myc-MYBPC3和总MYBPC3)的转录（图6A)。用特异性引物（在myc序列中的正向引物5'-GCA AAA GCT TAT TAG CGA GGA A-3'（SEQ ID NO:33)和在外显子 2 中的反向引物 5'-CAG GCC GTA CTT GTT GCT G-3'（SEQ ID勵:34))扩增外源性]\?^?031111?熟；并且用同时识别内源 性MYBPC3和外源性MYBPC3的引物（在外显子1中的正向引物5' -GGG GAA GAA GCC AGT CTC AG-3'（SEQ ID N0:35)和在外显子 2 中的反向引物 5' -CAG GCC GTA CTT GTT GCT G-3'（SEQ ID N0:34))扩增总MYBPC3mRNA。Myc-MYBPC3mRNA的水平随着病毒剂量的增加 而增加（图6A，左图）。在非转导的细胞（NT)和缺乏逆转录酶（-RT)的阴性对照中，未检 测到 Myc-MYBPC3mRNA。
[0120] 如前所述，使用针对cMyBP-C的CO-Cl结构域的抗体（图6B，总cMyBP-C，由合作 者友情提供）或针对myc标签的抗体（图6B，外源性myc-cMyBP-C (兔多克隆Sigma ;目录 号此3956))进行Western印迹分析。阳性对照（+)是经相同病毒转导的小鼠心肌细胞的 样品。在腺病毒基因转移后，总cMyBP-C的水平略有增加，而在非转导（NT)的样品中不存 在带myc标签的cMyBP-C蛋白，并且带myc标签的cMyBP-C蛋白的水平随着MOI的增加而 增加（图6B)。
[0121] 通过免疫荧光，分析外源性myc-cMyBP-C在源自iPSC的人心肌细胞中的定位。用 抗cMyBP-C的抗体对人心肌细胞进行染色（图6C，cMyBP-C)，示出预期的肌节横纹。用抗 myc的抗体对外源性cMyBP-C进行染色（图6C，myc)。抗myc的抗体与位于蛋白N末端的 myc标签结合。观察到，外源性带myc标签的cMyBP-C被正确地并入到源自人iPSC的心脏 细胞的肌节中，作为A带中的二联管。
[0122] 这些数据首次示出，外源性人myc_MYBPC3在源自iPSC的人心肌细胞中的表达。 外源性人myc-MYBPC3的表达产生并入肌节中的稳定的人cMyBP-C蛋白。因此，MYBPC3cDNA 的过表达可用于人肥厚型心肌病的基因治疗中。
[0123] 实施例7:长期Mybpc3基因治疗恢复了 Mybpc3mRNA的水平，并且部分预防了在 Mybpc3革El向敲入小鼠中的心肌肥厚和功能障碍。
[0124] 在心脏疾病表型出现之前，将不同剂量的腺相关病毒血清型 9 (AAV9) -Mybpc3 (I X IO11、3 X IO11、I X IO12和 3 X 10 12载体基因组（vg) / 小鼠）或 PBS 给药 到 1日龄Mybpc3靶向敲入（KI)小鼠的颞脉中。在34周后，对小鼠进行体内血流动力学和 组织分析。WT小鼠作为对照。
[0125] 对34周龄的WT小鼠、经PBS治疗的KI小鼠和以3X IO12Vg最高剂量治疗的KI 小鼠，分析收缩功能（=dP/dtmax)和舒张功能（=dP/dtmin)，并且测定心脏重量与体重 (Hff/BW)的比率（图7. 1A)。与WT相比，在KI小鼠中，通过Mybpc3基因治疗预防了收缩功 能轻微降低、舒张功能显著降低和HW/BW比率的显著增加。
[0126] 此外，进行了 RT-PCR，来评估外源性带FLAG标签的Mybpc3mRNA(图L 1B，上图） 和总Mybpc3mRNA(下图）的水平。从心室组织中提取RNA，并且将其汇集到各组（η = 5~ 10/组）中。PCR扩增条带的大小示于图7. IB的左侧。这示出了 Mybpc3(包括仅外源性 Mybpc3和总Mybpc3)的表达以AAV9-Mybpc3剂量依赖的方式增加。重要而又相反的是，突 变体mRNA的表达（由突变体-1、突变体-2和突变体-3的扩增子来表示）以AAV9-Mybpc3 剂量依赖的方式降低。
[0127] 此外，通过对34周龄的WT、经PBS治疗的KI和以3 X IO12Vg最高剂量治疗的KI小 鼠进行的RT-qPCR，测定总Mybpc3mRNA的水平（图7. 1C)。与WT相比，通过Mybpc3基因疗 法在KI小鼠中完全防止了 Mybpc3mRNA水平显著降低。
[0128] 进行Western印迹分析，来评估外源性带FLAG标签的cMyBP-C (图7. 2D，上图）和 总cMyBP-C(下图）的蛋白水平。汇集来自每组的心室蛋白提取物以进行分析。使用针对 FLAG表位或总cMyBP-C的抗体对印迹进行染色（各种条件的上部）。针对GAPDH的抗体用 作上样对照（各种条件的下部）。对于Mybpc3mRNA，示出MyBP-C (包括仅外源性MyBP-C和 总MyBP-C)的蛋白水平以AAV9-Mybpc3剂量依赖的方式增加。
[0129] 对cMyBP-C蛋白水平进行量化，相对于GAPDH进行标准化并且显示与WT的关系 (图7· 2E)。与WT相比，通过Mybpc3基因疗法在KI小鼠中显著防止了 cMyBP-C水平的显 著降低。
[0130] 总之，这些数据表明，长期Mybpc3基因治疗不仅恢复了在KI小鼠中的Mybpc3WT 的水平，而且还防止了突变体MybpC3mRNA的转录。这两者部分地显著防止了左心室肥厚的 发展和舒张功能障碍，（即肥厚型心肌病的关键特征）。
【主权项】
1. 一种表达外源性核酸序列的基因治疗载体，包括： (a) 编码功能性心脏肌节蛋白的核酸序列，以及 (b) 与所述核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子， 所述基因治疗载体用于治疗或预防哺乳动物主体的肥厚型心肌病的方法中，其中，所 述主体在编码所述心脏肌节蛋白的基因中携带促使发生肥厚型心肌病的突变。2. 根据权利要求1所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述心脏肌节蛋白选 自由β-肌球蛋白重链、室性肌球蛋白必需轻链1、室性肌球蛋白调节轻链2、心脏α-肌动 蛋白、α-原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白Τ、心肌肌钙蛋白I、心脏肌球蛋白结合蛋白C、四加半 LIM蛋白1和肌联蛋白组成的组。3. 根据权利要求1或2所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述心肌细胞特异 性启动子是人心肌肌钙蛋白Τ的启动子（hTNNT2)。4. 根据权利要求3所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述hTNNT2启动子包 括SEQIDN0:5的序列或者与SEQIDN0:5的序列具有80%序列同一性的序列。5. 根据权利要求1~4所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述心脏肌节蛋白 是心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)。6. 根据权利要求5所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述cMyBP-C蛋白包括 SEQIDNO:2的序列或者与SEQIDNO:2的序列具有80%序列同一性的变体。7. 根据权利要求1~6所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述载体是质粒或 病毒载体。8. 根据权利要求7所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述病毒载体选自由 腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、细小核糖核酸病毒、慢 病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒和甲病毒组成的组。9. 根据权利要求1~8所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述主体是人。10. 根据权利要求1~9所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述载体被配制 用于通过静脉内注射或心内注射，或通过输注给药到心肌内。11. 根据权利要求1~10所述的用于所述方法的基因治疗载体，其中，所述外源性核酸 序列的表达在所述主体中提供正常水平的所述心脏肌节蛋白，并且降低该蛋白的非功能性 突变体形式的水平。12. -种经根据权利要求1~11所述的载体转导的分离细胞。13. 根据权利要求11所述的分离细胞，所述分离细胞是人的细胞。14. 根据权利要求11或12所述的分离细胞，所述分离细胞是心脏细胞。15. 根据权利要求11或12所述的分离细胞，所述分离细胞是成体多能干细胞。16. -种药物组合物，包括根据权利要求1~11所述的基因治疗载体或根据权利要求 12~15所述的细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗或预防对其有需要的主体的肥厚型心肌病。本发明的基因治疗载体包括编码心脏肌节蛋白的核酸序列和与该核酸序列可操作地连接的心肌细胞特异性启动子。本发明还涉及一种包含基因治疗载体的细胞。还提供了包括上述基因治疗载体和/或含上述载体的细胞的药物组合物。另一个方面，本发明涉及一种通过将本发明的基因治疗载体引入需要治疗的主体中，来治疗或预防主体的肥厚型心肌病的方法。
【IPC分类】A61K48/00, A61K35/34, C12N15/85, A61P9/00, C12N15/86, A61K35/12, C12N5/10
【公开号】CN105378089
【申请号】CN201480034739
【发明人】卢西·卡里尔, 托马斯·艾斯臣哈根, 托马斯·沃伊特, 茱莉娅·米尔里尼, 奥立佛·穆勒, 多琳·斯蒂姆波, 朱莉娅·穆罗-费力亚特
【申请人】汉堡-艾本德大学医学中心, 鲁普莱希特-卡尔斯-海德堡大学, 皮埃尔-玛丽-居里大学, 肌肉学研究协会
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年4月17日
【公告号】EP2792742A1, EP2986712A1, US20160108430, WO2014170470A1