一种无标签单链型人源双特异性抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及一种单链型人源双特异性抗体 及其用途。
【背景技术】
[0002] B细胞恶性肿瘤是一类B淋巴细胞相关的恶性肿瘤，包括弥漫大B细胞淋巴瘤、 Burkitt淋巴瘤、B淋巴细胞白血病等，发病率较高，严重危害人类健康。B细胞恶性肿瘤细 胞表面表达较高的CD分子，如CD19、CD20和CD22等，可以作为抗体药物的治疗靶点。针 对这些CD分子的抗体药物能够介导肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗疾病的目的。目前，针对 ⑶19分子开发的抗体药物美罗华（Rituximab)已经被批准上市，用于治疗B细胞淋巴瘤。
[0003] T淋巴细胞是杀伤肿瘤的重要免疫细胞，其表面有CD3、白介素-2受体等分子。研 究表明，CD3抗体和白介素-2配体可以有效激活T淋巴细胞，诱导其活化和增殖，从而提高 其杀伤肿瘤细胞的活性，这些作用也已经被应用于肿瘤的免疫疗法。然而由于缺乏针对肿 瘤细胞的特异靶向性，因此这些T淋巴细胞对肿瘤杀伤的效能不足。如果把能够激活T淋 巴细胞的CD3抗体与靶向B细胞恶性肿瘤细胞的CD19抗体融合制备成CD3-CD19双特异性 抗体，则能够有效地在肿瘤细胞周围富集和活化T淋巴细胞，赋予T淋巴细胞特异靶向性， 从而显著提高T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的效果。
[0004] 作为一种肿瘤免疫疗法，T细胞治疗近年来发展迅速，受到很大关注。传统的T细 胞治疗如LAKXIK等，借助细胞因子在体外使目标T细胞大量扩增，然后输入肿瘤患者体内 发挥抗肿瘤作用。这种疗法的显著不足是缺乏针对肿瘤细胞的特异靶向性，因此所需要的 T细胞数量很大，不利于生产。CAR-T是另一种T细胞治疗方法，采用转基因技术使T细胞 获得肿瘤靶向性。然而，转基因技术操作相对复杂，质量控制难度较大，而且伦理上还有待 TG 口 〇
[0005] 人体内的天然抗体是由重链和轻链组成，其中重链可变区和轻链可变区结构对于 抗原的结合特别重要。由重链可变区和轻链可变区组成的融合蛋白（即单链抗体）仍然具 有良好的抗原结合活性。由两个不同单链抗体融合而成的单链型双特异性抗体的体积较 小，亲和力适中，具有较好的组织渗透能力。然而，单链抗体缺乏抗体恒定区，难以检测，因 此常规在单链抗体末端加入标签蛋白（如6个组氨酸标签、Flag标签、生物素标签等），以 达到检测和纯化的目的。然而，当带有标签蛋白的单链抗体用于人体治疗时，很有可能产生 抗标签蛋白抗体，从而影响药效，这在一定程度上限制了单链抗体作为药物的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的主要技术问题是现有单链抗体末端需要加入标签蛋白，从而可能 在使用时产生抗标签蛋白抗体，药效不佳的问题。本发明解决上述技术问题的技术方案是 提供了一种单链型双特异性抗体。该其单链型双特异性抗体是由抗人CD3的单链抗体和抗 人CD19的单链抗体直接连接得到或者通过连接肽连接得到，且不含标签蛋白。
[0007] 其中，上述的单链型双特异性抗体中的抗人CD3的单链抗体的为：
[0008] a)、氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO. 2所示的单链抗体；
[0009] 或者：
[0010] b)氨基酸序列为在SEQ ID NO. 2所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一 个或几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。
[0011] 其中，上述的单链型双特异性抗体中的抗人CD19所述的抗人CD19的单链抗体 为：
[0012] a)、氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO. 4所示的单链抗体；
[0013] 或者：
[0014] b)氨基酸序列为在SEQ ID NO. 4所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一 个或几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。
[0015] 优选的，上述的单链型双特异性抗体为：
[0016] a)、氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO. 6所示的抗体；
[0017] 或者：
[0018] b)氨基酸序列为在SEQ ID NO. 6所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一 个或几个氨基酸获得的与a)中所述的抗体的功能相同或相似的抗体。
[0019] 进一步的，上述的单链型双特异性抗体的氮端还连接有信号肽。
[0020] 此外，本发明还提供了编码上述单链型双特异性抗体的编码基因。
[0021] 进一步的，上述的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 5;或者其核苷酸序列为 SEQ ID NO. 5的简并序列。
[0022] 本发明还提供了含有上述编码基因的重组载体。所述的重组载体可为质粒载体或 者病毒载体。
[0023] 本发明还提供了含有上述重组载体的宿主细胞。所述的宿主细胞可以为原核细胞 或者真核细胞。
[0024] 同时，本发明还提供了上述单链型双特异性抗体在制备预防或者治疗B细胞恶性 肿瘤的药物中的用途。
[0025] 其中，所述的B细胞恶性肿瘤为：弥漫大B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、急性B淋 巴细胞白血病等B细胞恶性肿瘤。
[0026] 本发明的单链型双特异性抗体是由来自抗CD3抗体的可变区与抗CD19抗体的可 变区构成，之间由一条连接肽（Linker)相连。特别的是，该双特异性抗体不带有标签蛋白。
[0027] 上述单链型双特异性抗体中的抗⑶3抗体单链抗体由抗⑶3抗体的重链可变区 (VH)和轻链可变区（VL)融合而成，可表示为CD3scFv。进一步的，重链和轻链可变区间由 连接肽连接。常用的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 7)，可表示为 (G4S) 3。优选的，上述治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体中的CD3抗体可变区的核苷酸 序列为SEQ ID NO. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0028] 上述单链型双特异性抗体中的抗D19单链抗体是重链可变区（VH)和轻链可变区 (VL)融合而成，可表示为⑶19scFv。进一步的，重链和轻链可变区间由连接肽连接。常用 的连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，可表示为（G4S)3。优选的，上述治疗B细胞恶 性肿瘤的双特异性抗体中的CD19抗体可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示，其编码的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0029] 上述双特异性抗体的两个scFv结构之间可以使用链接肽连接接，其目的在于提 供一定的柔韧性，以避免⑶3scFv和⑶19scFv形成结构上的空间位阻。连接肽氨基酸序列 和长度均可以有一定的变化，也可以有很多本领域常用的链接肽供选择。比如，最常用的连 接肽的氨基酸序列为GGGGS (SEQ ID NO. 8)。
[0030] 进一步的，上述治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体由⑶3scFv和⑶19scFv通过 连接肽融合而成，可表示为⑶3scFv-⑶19scFv。优选的，上述治疗B细胞恶性肿瘤的双特异 性抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO. 5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0031] 本发明还提供了含有上述编码治疗B细胞恶性肿瘤的双特异性抗体核苷酸序列 的基因载体。该载体可选自质粒、病毒、DNA或RNA片段。
[0032] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种无标签的单链型人源⑶3-⑶19双特 异性抗体，相应的还提供了其检测方法。本发明的双特异性抗体可以稳定地与T淋巴细胞 和B细胞恶性肿瘤结合，这使得该双特异性抗体不仅可用于传统的药物疗法，还可以在体 外重塑T淋巴细胞，以细胞治疗的方式在极低效靶比情况下杀伤肿瘤细胞。因此，本发明的 双特异性抗体具有更佳的人体适用性和更广泛的用途。
【附图说明】
[0033] 图L重组载体双酶切鉴定。
[0034] 图2.免疫印迹检测宿主细胞表达分泌双特异性抗体。
[0035] 图3.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测双特异性抗体的纯化。
[0036] 图4.流式细胞术显示本发明双特异性抗体可以特异结合相应的靶细胞。A :K562 ; B :Jurkat ;C :SU-DHL-6。
[0037] 图5.免疫荧光显示本发明双特异性抗体可以特异结合相应的靶细胞。A :K562 ;B : T淋巴细胞；C :Ramos。
[0038] 图6. ELISA检测本发明双特异性抗体与靶细胞结合的时间效应。A :Jurkat ;B : Raji0
[0039] 图7.本发明双特异性抗体介导的T淋巴细胞与Pfeiffer细胞的桥接作用。A :双 特异性抗体；B :0KT3。
[0040] 图8.本发明双特异性抗体可以激活人外周血T