发明利用人外周血淋巴细胞来检测本发明双特异性抗体对T淋巴细胞的激活 效应。
[0101] 在6板内接种人外周血淋巴细胞（0. 5X IO6/孔），将双特异性抗体加入到细胞培 养孔（10ng/mL和1000ng/mL)。阳性对照孔中加入0KT3对照抗体（1000ng/mL)，阴性对照 孔中加入等体积PBS。继续培养细胞48小时后，在显微镜下观察T淋巴细胞增殖情况。结 果显示，在加入本发明双特异性抗体的孔中，可以见到明显的T淋巴细胞增殖克隆，其与阳 性对照0KT3相似，而阴性对照PBS孔中则未见明显的T淋巴细胞克隆形成，说明本发明的 双特异性抗体能够有效激活T淋巴细胞（见图8)。
[0102] 实施例八本发明双特异性抗体可以在体外能够以多种治疗方式介导T淋巴细胞 杀伤B细胞恶性肿瘤细胞
[0103] 本发明利用人T淋巴细胞、弥漫大B细胞淋巴瘤细胞SU-DHL-6、Burkitt淋巴瘤细 胞Raji、急性B淋巴细胞白血病细胞RS4 ;11作为模型，并采用直接给药、细胞疗法等多种 方式来检测双特异性抗体介导的T淋巴细胞对B细胞恶性肿瘤细胞的杀伤作用。
[0104] 1、本发明双特异性抗体可以直接给药方式介导T淋巴细胞杀伤SU-DHL-6细胞。
[0105] 在96孔细胞培养板内接种SU-DHL-6细胞（I X IO4/孔），按照T淋巴细胞与 SU-DHL-6细胞的不同比例（效靶比=10、20、50)，将T淋巴细胞加入到培养板内，同时将不 同浓度的双特异性抗体（PBS，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL)加入到细胞培养孔，继续培 养细胞96小时，最后采用乳酸脱氢酶（LDH)释放法检测试剂盒检测细胞的杀伤效应，分析 细胞的生长情况。结果显示，本发明的双特异性抗体能够有效介导T淋巴细胞对SU-DHL-6 细胞的杀伤（见图9)。
[0106] 2、本发明双特异性抗体重塑后的T淋巴细胞可以有效杀伤Raji细胞。
[0107] 在本实验中，先使用不同浓度的双特异性抗体（PBS，0. 25ug/mL，0. 5ug/mL，lug/ mL)在室温条件下孵育T淋巴细胞30分钟，完成对T淋巴细胞的体外重塑。重塑完毕后，使 用PBS洗涤T淋巴细胞2次，以去除未结合的游离抗体。按照T淋巴细胞与Raji细胞的不 同比例（效靶比=10、20、50)，将重塑的T淋巴细胞加入到含有Raji细胞（IX IO4/孔）的 96孔板内，继续培养细胞96小时，最后采用乳酸脱氢酶（LDH)释放法检测试剂盒检测细胞 的杀伤效应，分析细胞的生长情况。结果显示，本发明双特异性抗体重塑的T淋巴细胞能够 有效杀伤Raji细胞（见图10)。
[0108] 3、本发明双特异性抗体重塑后的LAK细胞可以有效杀伤RS4 ;11细胞。
[0109] 在本实验中，先使用不同浓度的双特异性抗体（PBS，lug/mL)在室温条件下孵育 LAK细胞30分钟，完成对LAK细胞的体外重塑。重塑完毕后，使用PBS洗涤LAK细胞2次， 以去除未结合的游离抗体。按照LAK细胞与RS4;11细胞的不同比例（效靶比=1、2、5)， 加入到含有RS4 ;11细胞（IX IO4/孔）的96孔板内，继续培养细胞96小时，最后采用乳酸 脱氢酶（LDH)释放法检测试剂盒检测细胞的杀伤效应，分析细胞的生长情况。结果显示，本 发明双特异性抗体重塑的LAK细胞在极低的效靶比情况下（效靶比=1、2、5)就可以有效 杀伤RS4 ;11细胞（见图11)。
[0110] 实施例九本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK可以靶向到荷瘤小鼠的肿瘤部 位
[0111] 本发明通过活体成像技术，分析本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK在荷瘤小 鼠体内的分布情况，来探究靶向性LAK在荷瘤小鼠体内的肿瘤靶向性。
[0112] 使用近红外荧光（NIR)染料对LAK细胞孵育标记40分钟，用培养基清洗1次并重 悬，然后再分别与双特异性抗体（1 μ g/mL)和0KT3 (1 μ g/mL)孵育30分钟，以完成对LAK细 胞的重塑。重塑完毕后，用培养基清洗1次，以去除未结合的游离抗体。把细胞重悬于PBS， 于尾静脉部位注射入已建立好的Raji皮下瘤N0D/SCID小鼠体内。注射2小时后，采用活体 成像仪进行检测分析。结果显示，本发明双特异性抗体重塑的LAK可以靶向到荷瘤小鼠的 肿瘤部位，而对照LAK缺乏良好的肿瘤靶向性，说明本发明双特异性抗体重塑的靶向性LAK 具有较好的肿瘤靶向性（见图12)。
[0113] 实施例十本发明双特异性抗体以靶向性LAK细胞疗法抑制小鼠体内B细胞恶性 肿瘤的生长
[0114] 本发明以Raji皮下瘤N0D/SCID小鼠为模型，采用本发明双特异性抗体重塑的靶 向性LAK来分析本发明双特异性抗体的抗肿瘤应用。
[0115] 将N0D/SCID雌鼠随机分为三组，每组5只。三组小鼠均在无菌条件下于腹背右侧 皮下接种Raji细胞（为5X IO6个）。接瘤24小时后进行治疗。第一组小鼠给予PBS ;第 二组小鼠给予0KT3孵育后的LAK细胞（效靶比=1);第三组小鼠给予本发明双特异性抗体 重塑后的靶向性LAK细胞（效靶比=1)。每天尾静脉注射1次，连续治疗4天，30天后检 测小鼠成瘤性。结果表明，PBS组和非靶向LAK组中的5只小鼠均成瘤。相反，靶向性LAK 组的5只小鼠中仅有2只成瘤，且肿瘤体积较小，这说明本发明双特异性抗体重塑的靶向性 LAK在极低效靶比情况下就可以发挥明显的抑瘤作用（见图13)。
[0116] 上述实例表明，本发明的无标签单链型人源⑶3-⑶19双特异性抗体可以在DG44 细胞中表达，并可以被本发明中采用的多种无标签检测方法检测。本发明的双特异性抗体 能够特异结合CD3阳性和CD19阳性的靶细胞，并且可以激活人外周血T淋巴细胞。本发明 的双特异性抗体除了传统的直接给药疗法外，还可以在极低效靶比情况下以靶向性细胞疗 法来杀伤B细胞恶性肿瘤，因此该双特异性抗体具有更佳的人体适用性和更广泛的用途。
【主权项】
1. 单链型双特异性抗体，其特征在于：是由抗人CD3的单链抗体和抗人CD19的单链抗 体直接连接得到或者通过连接肽连接得到，且不含标签蛋白。2. 根据权利要求1所述的单链型双特异性抗体，其特征在于：所述的抗人CD3的单链 抗体为： a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO. 2所示的单链抗体； 或者： b) 氨基酸序列为在SEQIDNO. 2所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。3. 根据权利要求1所述的单链型双特异性抗体，其特征在于：所述的抗人CD19的单链 抗体为： a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO. 4所示的单链抗体； 或者： b) 氨基酸序列为在SEQIDNO. 4所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸获得的与a)中所述的单链抗体的功能相同或相似的抗体。4. 根据权利要求1所述的单链型双特异性抗体，其特征在于所述的单链型双特异性抗 体为： a)、氨基酸序列为序列表中SEQIDNO. 6所示的抗体； 或者： b) 氨基酸序列为在SEQIDNO. 6所示序列的基础上取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸获得的与a)中所述的抗体的功能相同或相似的抗体。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的单链型双特异性抗体，其特征在于，在其氮端还 连接有信号肽。6. 编码权利要求1~5中任一项所述的单链型双特异性抗体的编码基因。7. 根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO. 5 ;或者 其核苷酸序列为SEQIDNO. 5的简并序列。8. 含权利要求6或7所述编码基因的重组载体。9. 含权利要求8所述重组载体的宿主细胞。10. 权利要求1~5中任一项所述的单链型双特异性抗体在制备预防或者治疗B细胞 恶性肿瘤的药物中的用途。
【专利摘要】本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及编码包含人源CD3抗体可变区与人源CD19抗体可变区片段的重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白等。本发明提供的是一种无标签的单链型人源CD3-CD19双特异性抗体，并提供了相应的检测方法。本发明的双特异性抗体不仅可用于传统的直接给药疗法，还可以在体外重塑T淋巴细胞，以靶向性细胞疗法在极低效靶比情况下杀伤肿瘤细胞。因此，本发明双特异性抗体具有更佳的人体适用性和更广泛的用途。
【IPC分类】C12N15/13, C12N5/10, A61P35/00, C07K16/30, C07K16/46, C12N15/85, A61K39/395
【公开号】CN105399832
【申请号】CN201510895910
【发明人】勾蓝图, 杨金亮, 魏于全
【申请人】四川大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月7日