一种固液结合制备特利加压素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固相和液相结合制备特利加压素的方法。
技术背景
[0002]特利加压素(Terlipressin)最早由Ferring公司开发，于1977年首先在荷兰作为止血药上市，商品名为Glypressin;之后又以商品名Glypressine在法国、德国、英国上市，用于治疗消化道静脉曲张出血;Ferring公司于1999年，在中国取得该品种的上市许可。
[0003]特利加压素为赖氨酸加压素衍生物，本身无活性，在体内经氨基肽酶作用，脱去其N末端的3个甘氨酰残基后，缓慢“释放”出有活性的赖氨酸加压素。其结构如下:Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly-NH2
[0004]Ferring公司申请的专利SK278755(CZ281589)采用Boc保护氨基酸固相合成工艺制备特利加压素，此合成工艺中用到HF，对生产设备要求较高，三废较严重，规模放大较困难。专利CN1865282B采用Fmoc保护氨基酸固相合成工艺制备特利加压素，避免了 HF的使用，降低了对环境的污染;其氧化工艺为液相氧化，溶液浓度不能过高，操作复杂，副反应较多，后期纯化难度较大，生产成本高。专利CN101693738A同样采用Fmoc保护氨基酸固相合成了线性特利加压素肽树脂，然后采用碘氧化固相成环工艺形成二硫键，然后经裂解，纯化、冻干得精肽，简化了操作过程，便于规模性放大;但是存在成环较困难，粗肽纯度较低的缺点。专利CN102408471A，为了解决工艺中容易产生特利加压素土Gly的杂质，特采用Fmoc-Gly-0H和CTC树脂合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-CTC树脂，然后经裂解得到单体Fmoc-Gly-Gly-Gly-0H，在固相接肽合成线性特利加压素肽树脂;虽然有效的避免了特利加压素±617的杂质的产生，但是提高了生产成本。专利CN104371008A采用片段合成的方法来制备特利加压素，其公布的液相合成Boc-Gly-Gly-Gly-OH或Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH方法，需要经过偶联、脱保护、再偶联、再脱保护等四个步骤，且所选原料H-Gly-OMe或Η-Gly-OtBu价格较高，整个制备过程操作复杂，不适合规模放大生产。
[0005]本发明人为了解决特利加压素±617杂质的生成，降低纯化难度；同时为了简化特利加压素的生产工艺，提高收率，降低生产成本，对特利加压素的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种特利加压素的固相和液相相结合的制备方法。本发明采用常规的保护氨基酸作为起始原料，降低了合成难度，提高了精肽纯度，降低了生产成本，有利于规模化工业生产。
[0007]为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0008]—种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0009](a)以Boc-Gly-OH和双甘肽为原料，液相合成片段肽A:BoC-Gly-Gly-Gly-0H;
[0010](b)以Fmoc保护氨基酸和氨基树脂依次偶联，固相合成片段肽B树脂:
[0011 ] H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(T;rt)-Cys]-P;ro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂
[0012](c)片段肽A和片段肽B树脂偶联，固相合成特利加压素的肽树脂:
[0013]Boc-Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-GIn(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂
[0014](d)特利加压素肽树脂经裂解、纯化、转盐、冻干得醋酸特利加压素精肽。
[0015]以上技术方案中，步骤(a)的具体操作步骤为:
[0016]将Boc-Gly-OH和HOSu按照摩尔比1:1?1.2的比例溶解在四氢呋喃中，待完全溶解后，冰水浴下滴加入1.0-1.2倍摩尔量(以Boc-Gly-OH的量计)的DCC四氢呋喃溶液;撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3-4h;滤除白色沉淀，四氢呋喃洗涤3次，合并洗液和滤液;旋蒸浓缩滤液和洗液至原体积的1/3，加入石油醚析晶，过滤得白色固体Boc-Gly-OSu，抽干后待用；
[0017]将双甘肽与碱A按照摩尔比1:1?2的比例溶解在水中，加入5?20%体积的有机溶剂B助溶，待完全溶解后，搅拌下滴加入0.5?1.0倍摩尔量(以双甘肽的量计)Boc-Gly-OSu的有机溶剂B溶液;继续搅拌反应，TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，析晶得Boc-Gly-Gly-Gly-OH。
[0018]以上步骤中，所述碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N，N-二异丙基乙胺等中的一种;有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
[0019]以上技术方案中，步骤(b)中片段肽B树脂合成的具体操作步骤为:以Rinkamideresins或Rink amide AM resins为固相载体，经脱保护试剂处理后，以2_5倍的摩尔投料比，加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，得到H-Cys (Trt)-Tyr (OtBu )-Phe_Gln( Trt) _Asn( Trt )_Cys (Trt)-Pro-Lys(B0C)-Gly-氨基树脂；然后用2-5倍的摩尔投料比，加入碘的DMF溶液，氧化反应40?120min，然后 DMF 洗涤树脂六次，得到片段肽 B 树脂:H-C[CyS-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-ASn(Trt) -Cys ] -Pro-Lys (Boc )-Gly-氨基树脂。
[0020]以上技术方案，步骤(c)的具体操作步骤为:称取2-5倍摩尔投料比Boc-Gly-Gly-Gly-0H和缩合剂，放入溶解瓶中，加入DMF溶解完全，加入装有片段肽B树脂的合成柱中，室温下搅拌反应，kaiseH式剂检测反应终点。
[0021 ] 其中步骤(b)或(c)中所述氨基树脂为Rink amide resins和Rink amide AMres ins中的一种，树脂替代度为0.4_1.2mmol/g。
[0022]其中步骤(b)或(c)中的具体操作步骤中所述缩合剂为DIC/H0BT、DIC/H0AT、TBTU/H0BT/DIPEA、HBTU/H0BT/DIPEA、HATU/H0AT/DIPEA 的一种；脱保护试剂为 15 ?25%(体积含量)哌啶/DMF溶液。
[0023]以上技术方案，步骤(d)中裂解所用裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或几种。
[0024]本发明的有益效果为:
[0025]1)、本申请采用双甘肽作为起始原料，其价格便宜且易获得，利用双甘肽在碱性条件下可以和Boc-Gly-Osu发生偶联反应，生成Boc-Gly-Gly-Gly-OH的性质，简化了其制备过程，降低了合成成本，提高了终产品的纯度；
[0026]2)、本发明中二硫键的形成工艺，采用了先制备H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe_Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂，然后固相条件下碘氧化的方法，这样可以减少Fmoc-Gly-Gly-Gly-基团的空间位阻，有利于二硫键的形成，提高粗肽的纯度。
[0027]说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下:
[0028]Fmoc9_荷甲氧幾基
[0029]Rink amide resinsRink酰胺树脂
[0030]Rink amide AM resins Rink酰胺AM树脂[0031 ]tBu 叔丁基
[0032]Trt三苯甲基
[0033]Boc叔丁氧羰基
[0034]NMPN-甲基-2-吡咯烷酮
[0035]DCM二氯甲烷
[0036]DMFN，N-二甲基甲酰胺
[0037]DMAP4-二甲氨基吡啶
[0038]DIPEAN，N_ 二异丙基乙胺
[0039]DICN，N-二异丙基碳二亚胺
[0040]HBTU苯并三氮唑4少少’4’-四甲基脲六氟磷酸盐
[0041 ]HATU 2-(7-偶氮苯并三氮挫)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
[0042]TBTU0-苯并三氮唑州少少’4’-四甲基脲四氟硼酸
[0043]Η0ΒΤ1-轻基苯并三唑
[0044]Η0ΑΤ1-轻基-7-偶氮苯并三氮唑
[0045]TFA三氟乙酸
[0046]TIS三异丙基硅烷
【具体实施方式】
[0047]下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利;根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
[0048]实施例1:Boc-Gly-Gly-Gly-0H 的制备
[0049]准确称取Boc_Gly-0H105.lg(0.6mol)和H0Su69.0g(0.6mol)溶于 1.2L四氣咲喃中，待完全溶解后，低温(2-8°C)下滴加入DCC123.6g(0.6mol)四氢呋喃溶液600ml;撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3h;滤除白色沉淀，300ml四氢呋喃洗涤3次，合并洗液和滤液;旋蒸浓缩滤液和洗液至1.0L，加入3.0L石油醚析晶，过滤得白色固体，石油醚洗涤三次，抽干后用1.0L四氢呋喃复溶，待用；
[0050]准确称取双甘肽Gly-Gly-0H79.8g(0.6mol)和碳酸钠 127.2g( 1.2mol)溶于1200mL水中，低温下(2-8°C)缓慢加入Boc-Gly-OSu的四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10 %柠檬酸水溶液调溶液pH值至2?3，1000ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相