一种谷氨酸生产菌株及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种谷氨酸生产菌株的制备方法，以及该方法制备的谷氨酸生产菌 株。
【背景技术】
[0002] 工业生产和学术研究一般使用具有产生L-谷氨酸能力的棒状杆菌属 (Corynebacterium spp.)或短杆菌属（Brevibacterium spp.)细菌（现在一般认为短杆菌 属细菌也属于棒状杆菌属）发酵产生L-谷氨酸。为了提高这些产生L-谷氨酸细菌的生产 能力，使用从自然界分离的细菌菌株，或它们的人工突变菌株或通过基因重组修饰的菌株。
[0003] 在谷氨酸代谢通路上的某些环节中的限速步骤中，对相关基因及其产物进行过量 表达，从而提高谷氨酸合成途径上某些关键酶在生产菌株胞内的数量和/或活力，是提高 谷氨酸产量的常用策略；同样，在合成途径某些节点上的酶会分散主代谢途径上的物质和 /或能量流，或者产生某些不需要的副产物。在这种情况下，通过降低代谢通路节点上对主 代谢流有分流作用的内源酶的数量和/或活力，从而增加主代谢通路上的代谢能力并提高 产物产量，也是谷氨酸菌株代谢工程和遗传育种的重要手段。
[0004] 上调基因表达水平典型的方法主要是向宿主菌转化携带编码靶基因核酸序列且 可自主复制的质粒载体，这种方法常常存在两个问题：一是胞内目的基因拷贝数过多，造成 该基因的超剂量表达，而这种超剂量表达的目的蛋白会造成整个胞内的代谢失衡，反而降 低宿主菌的生长和生产速率；二是许多表达质粒载体需要诱导型启动子，这在工业生产中 会增加额外成本。其他还包括在基因组上增加基因的拷贝数量，在合适的基因组位置上插 入强启动子以调苄基因拷贝在基因组上的转录强度，和通过优化核糖体结合位点（RBS)序 列，而这些方法的操作常常比较复杂。
[0005] 下调基因表达水平典型的方法主要是基因敲除、反义技术、RNAi等基因操作技术， 但是，这些技术往往造成在敲除靶基因的同时完全丧失某种内源酶活性，影响细菌某一方 面的生理功能甚至影响细菌的生长、增殖。在仅需要在一定程度上降低某种酶蛋白数量的 应用情况下，以上基因下调表达水平技术将会出现问题，因此，可以通过将靶基因野生型的 启动子替换成较弱启动子的方式来降低酶蛋白表达量，但是寻找一种比靶基因的野生型启 动子弱的突变启动子的实验操作比较麻烦，而且费时费力。
[0006] 因此，目前需要一种简单的、适度的、精细的靶基因调控方法，该方法能够在不改 变基因组拷贝数且不对谷氨酸生产菌株生长及代谢产生显著影响的基础上提高谷氨酸的 产量。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术中提高谷氨酸表达量会导致基因组拷贝数改变，且 方法复杂、不易操作和控制的缺陷，提供一种谷氨酸生产菌株的制备方法，以及该方法制备 的谷氨酸生产菌株。
[0008] 本发明的发明人在研究中发现，通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至 少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至 少部分替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列，能够在不改变基 因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下提高谷氨酸的表达量，且方法简单、易于操作和控 制。
[0009] 因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种谷氨酸生产菌株的制备方法，该方法 包括将生产谷氨酸的野生菌株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改 造，密码子偏好性改造的方式为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分 替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分 替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列。
[0010] 另一方面，本发明还提供了由上述方法制备的谷氨酸生产菌株。
[0011] 本发明中，利用密码子的简并性和生产谷氨酸的野生菌株对不同密码子的偏好 性，将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或 通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，能够在 不改变基因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下，提高谷氨酸的产量，制得产生谷氨酸能 力较强的谷氨酸生产菌株。
[0012] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【具体实施方式】
[0013] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0014] 本发明提供了一种谷氨酸生产菌株的制备方法，该方法包括将生产谷氨酸的野生 菌株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改造，密码子偏好性改造的方 式为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子， 和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子， 得到经密码子偏好性改造的基因序列。
[0015] 本领域的技术人员应该理解的是，为了便于操作，通过将促进谷氨酸产生的基因 所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，具体的方法是将促进谷氨酸产生的基 因的有义链上的碱基进行替换，使得该有义链转录得到的mRNA上的密码子至少部分为偏 好性高的密码子；通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低 的密码子，具体的方法是将抑制谷氨酸产生的基因的有义链上的碱基进行替换，使得该有 义链转录得到的mRNA上的密码子至少部分为偏好性低的密码子。在此，有义链是指DNA双 链在转录过程中与转录形成的mRNA序列相同（T对应U)的那条单链叫做有义链。
[0016] 根据本发明所述的方法，其中，对进行密码子偏好性改造的量没有特别的限定， 例如可以为：以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将促进谷氨酸产 生的基因所对应的密码子的〇. 01-50%替换为偏好性高的密码子；和/或以抑制谷氨酸 产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子的 0. 01-50 %替换为偏好性低的密码子。
[0017] 本发明的发明人在研究中发现，当以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子 数为基准，将促进谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20%密码子替换为偏好性高 的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将该抑制谷氨 酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20%密码子替换为偏好性低的密码子时，能够进一 步提高谷氨酸的产量。在此，"起始密码子"指的是基因的有义链上的起始密码子序列。在 本发明中，从起始密码子开始均指包括该起始密码子。
[0018] 根据本发明所述的方法，其中，谷氨酸代谢通路上的酶可以为任何能够影响谷氨 酸表达量变化的酶，例如，促进谷氨酸产生的酶可以为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化 酶、丙酮酸脱氢酶系、柠檬酸合酶和机械应力敏感型谷氨酸外排蛋白（NCgll221)中的至少 一种，抑制谷氨酸产生的酶可以为乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基（DtsRl)、a-酮戊二 酸脱氢酶系、乳酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶中的至少一种。
[0019] 更优选地，当促进谷氨酸产生的酶为机械应力敏感型谷氨酸外排蛋白（NCgll221) 时，能够进一步提高谷氨酸的产量；当抑制谷氨酸产生的酶为乙酰辅酶A羧化酶羧基转移 酶亚基（DtsRl)时，能够进一步提高谷氨酸的产量。
[0020] 根据本发明所述的方法，其中，所述生产谷氨酸的野生菌株可以为本领域 常规的用于生产谷氨酸的野生菌株，例如可以为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)、高效棒状杆菌（C.efficiens)和黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)中的 至少一种，优选为谷氨酸棒状杆菌，能够进一步提高谷氨酸的产量。
[0021] 根据本发明所述的方法，其中，对于上述生产谷氨酸的野生菌株而言，偏好性高的 密码子可以包括：起始密码子AUG、苯丙氨酸密码子UUC、亮氨酸密码子CUG或CUC、异亮氨 酸密码子AUC、缬氨酸密码子GUU或GUC、酪氨酸密码子UAC、组氨酸密码子CAC、谷氨酰胺密 码子CAG、天冬酰胺密码子AAC、赖氨酸密码子AAG、天冬氨酸密码子GAU、谷氨酸密码子GAA、 丝氨酸密码子UCC或UCU、脯氨酸密码子CCA或CCU、苏氨酸密码子ACC或ACU、丙氨酸密码 子GCA或GCU、半胱氨酸密码子UGC、精氨酸密码子CGC或CGU ;所述偏好性低的密码子可以 包括：起始密码子UUG或GUG、苯丙氨酸密码子UUU、亮氨酸密码子UUA或CUA、异亮氨酸密 码子AUA、缬氨酸密码子GUA、酪氨酸密码子UAU、组氨酸密码子CAU、谷氨酰胺密码子CAA、 天冬酰胺密码子AAU、赖氨酸密码子AAA、天冬氨酸密码子GAC、谷氨酸密码子GAG、丝氨酸密 码子AGC或AGU、脯氨酸密码子CCC或CCG、苏氨酸密码子ACG或ACA、丙氨酸密码子GCG或 GCC、半胱氨酸密码子UGU、精氨酸密码子AGG或AGA。
[0022] 本领域的技术人员应该理解的是，该方法还可以包括先获得需要进行密码子改造 的靶基因的初始同源序列，具体方法可以为：根据数据库上公布的生产谷氨酸的野生菌株 的谷氨酸代谢通路上靶基因的基因序列，或者利用PCR的方法从生产谷氨酸的野生菌株的 基因组上扩增靶基因并进行测序，从而获得靶基因的初始同源序列。在此，靶基因的初始同 源序列是指含有上述编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因的序列。
[0023] 根据本发明所述的方法，其中，该方法还可以包括：将经密码子偏好性改造的基因 序列用于构建具有经密码子偏好性改造的基因的质粒，将所述质粒转化生产谷氨酸的野生 菌株的感受态细胞，然后进行菌株筛选，得到谷氨酸生产菌株。
[0024] 本发明中，将经密码子偏好性改造的基因序列用于构建具有经密码子偏好性改造 的基因的质粒的方法可以为本领域的常规方法，例如可以为：（1)在经密码子偏好性改造 的基因序列的起始密码子的上游添加该基因上游的初始同源序列l〇〇〇bp，并在该lOOObp 的初始同源序列前添加 Xba I限制性内切酶识别序列（TCTAGA)，在该Xba I限制性内切酶 识别序列前添加保护碱基（GCG);从起始密码子开始的已进行密码子替换的DNA片段的下 游取lOOObp的该基因的序列，在该lOOObp的基因序列后添加 Hind III限制性内切酶识别 序列（AAGCTT)，在该Hind III限制性内切酶识别序列后添加保护碱基（CGC)，从而获得待 合成的基因序列；（2)待合成的基因序列；（3)采用Xba I限制性内切酶和Hind III限制 性内切酶将上述已合成的基因序列进行双酶切，并将质粒采用同样的酶和方法也进行双酶 切，然后将上述经过双酶切得到的两类产物进行连接反应，构建得到具有经密码子偏好性 改造的基因