的质粒。其中，未构建前的质粒可以为pK18mobsacB、pK19mobsacB和pDXW-8中 的至少一种，优选为pK18mobsacB。
[0025] 本发明中，将上述构建的质粒转化生产谷氨酸的野生菌株的感受态细胞，的方法 可以为本领域常规的转化方法，例如可以为电击转化或化学转化法。其中，感受态细胞可以 商购或制备。
[0026] 当感受态细胞为制备的感受态细胞时，其制备方法可以为本领域常规的制备 感受态细胞的方法，例如可以为：a、挑取在固体培养基平板上生长了 1天的生产谷氨酸 的野生菌株的单菌落接种到含5-10mL正常液体培养基的大试管中，30-32°C培养过夜； b、取400-450 μ L种子液转接到30-35mL制备感受态所需液体培养基中，在30-32 °C下 150-160rpm的转速下振荡培养，至0D_达到0. 8-0. 9时（该过程需要3-5h)，在冷冻离心 机中4°C下，8000rpm收集细胞；c、用10% (v/v)的甘油洗涤细胞3-4遍，最后将细胞悬浮 在0.5mL 10%的甘油中；d、将制得的感受态细胞置于-80°C超低温冰箱中保存，现用现取， 使用时置于冰上融化使用。
[0027] 本发明中，电击转化生产谷氨酸的野生菌株的感受态细胞的方法可以为本领域常 规的电击转化的方法，例如可以为：a、取50-60 μ L感受态细胞与5-6 μ L已构建完成的具有 经密码子偏好性改造的基因的质粒混合均匀，转入预冷的0. 2cm -次性无菌电转杯中；b、 将电转杯置于冰浴上20min ;c、冰浴后在电转参数为25 μ F、2. 5kV、电击时间为5-8ms的条 件下进行电击转化；d、电转化结束后，立即加入600-800 μ L的正常液体培养基；e、46-50°C 水浴中热击6-7min ;f、热击结束后将电转化后细胞在30-32°C条件下温育2-3h ;g、5000rpm 离心2min收集细胞，除去多余上清，留100-200 μ L上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基 上进行筛选涂布。
[0028] 本发明中，菌株筛选方法可以本领域常规的筛选方法，例如可以为：a、将上述重悬 细胞均匀涂布在含有25-26 μ g/mL抗生素的LB固体培养基平板上，30-32°C条件下静置培 养24-48h，待长出菌落后挑取具有抗性的菌落至含有5mL LB液体培养基中，180rpm振荡培 养12h后备用；b、吸取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100 μ L，均匀涂布在含有100g/ L蔗糖的LB固体培养基平板上，能够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗 糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞，将该菌株细胞进行基因 PCR扩增实验；c、将扩增实验显 阳性的菌株进行液体扩大培养，并利用细菌质粒提取试剂盒对含有经密码子偏好性改造的 基因的质粒的谷氨酸生产野生菌株进行质粒提取，然后以该提取的质粒为模板进行PCR扩 增；d、将步骤c中PCR扩增产物序列送测序公司进行测定，若测序结果与上述待合成的序列 相同，则证明经密码子偏好性改造的基因的质粒已导入到了的生产谷氨酸的野生菌株中。
[0029] 本发明中，产生谷氨酸的能力是指当在培养基中培养利用本发明所述方法制得的 谷氨酸生产菌株时，在培养基或细胞中积累并向胞外运输L-谷氨酸的能力。
[0030] 本发明中，采用制得的谷氨酸生产菌株进行发酵培养来判断该菌株产生谷氨酸的 能力。其中，发酵培养的方法可以为本领域常规的用于谷氨酸生产的发酵方法。例如发酵 培养的方法可以为：分别将冻存于_8〇°C冰箱中的甘油冻存管中谷氨酸生产菌株接种于谷 氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，然后过夜培养，将过夜培养液进行扩大培养，制得种子 液；以10体积％的接种量分别将上述种子液接种至装有2-3L谷氨酸生产发酵培养基的 5L全自动发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为30-32°C，初始通气量为l_2L/min，初始 搅拌速度为500-600rpm，发酵过程中相关参数控制可以如下：温度：采用间隔升温方式控 制发酵温度，即控制发酵起始温度为30-32°C，并且每间隔3-5h使发酵温度提高0. 5°C ;溶 氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使发酵菌种 在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5% -10%，而在产酸旺盛的对数生长期溶 氧浓度控制在20% -25% ;pH :发酵过程中自动流加25重量％的氨水控制发酵液的pH在 7. 0-7. 2 ;泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况流加15-25% (w/v)浓度的泡敌进行消泡； 补料：当残糖含量降至1 %时，采用流加40-60% (w/v)浓度葡萄糖溶液进行补料。
[0031] 实施例
[0032] 以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0033] 在以下实施例和对比例中所涉及的培养基的种类和组成如下：
[0034] (1)LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl ;LB固体培养基：10g/ L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，15g/L琼脂；
[0035] (2)谷氨酸棒杆菌液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L葡 萄糖；谷氨酸棒杆菌固体培养基：l〇g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L葡萄糖， 15g/L琼脂；
[0036] (3)制备谷氨酸棒杆菌感受态所需的培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L葡萄糖，40g/L甘氨酸；
[0037] (4)谷氨酸生产种子培养基：26g/L葡萄糖，2. 8g/L玉米楽，5. 6g/L尿素，1. 6g/ LK2HP04 · 3Η20,0· 5g/L MgS04 · 7H20, pH = 7· 1±0· 1 ;
[0038] (5)谷氨酸生产发酵培养基：140g/L葡萄糖，3.0g/L玉米浆，2.0g/L糖蜜，2.0g/ LNa2HP04 · 12H20,1. 5g/L KC1，0. 6g/L MgS04 · 7H20,2mg/L MnS04 · H20,2mg/LFeS04 · 7H20， 0.211^/1维生素81，？!1=7.1±0.1。
[0039] 在以下实施例和对比例中，pK18mobsacB质粒购自中国质粒载体菌株细胞基因保 藏中心，货号为SMD1168H ;谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032购自中国工业微生物菌种保 藏管理中心，货号为CICC20213 ;谷氨酸棒杆菌野生菌株S9114购自中国工业微生物菌种保 藏管理中心，货号为CICC20935。双酶切试剂为购自天根生化科技（北京）有限公司的试剂 盒，连接反应试剂为购自天根生化科技（北京）有限公司的试剂盒。
[0040] 所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1。
[0041] 表 1
[0042]
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
[0045] (1)在GenBank数据库上查找已公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032野生菌株的乙酰 辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基基因 dtsRl序列（Gene ID :3345446) (SEQ ID No :1)的同源 序列；
[0046] (2)对上述dtsRl基因序列（SEQ ID No :1)进行密码子偏好性改造，具体步骤为： 将dtsRl基因序列的有义链的从起始密码子开始的前180bp (相当于60个密码子）进行替 换，使得该基因有义链转录得到的mRNA上的前60个密码子均为偏好性低的密码子，从而得 到经密码子偏好性改造的基因序列dtsRl*(SEQ ID No :2);
[0047] (3)将基因序列dtsRl*的起始密码子的上游添加该基因上游的初始同源序列 lOOObp，并在该lOOObp的初始同源序列前添加 Xba I限制性内切酶识别序列（TCTAGA)，在 该Xba I限制性内切酶识别序列前添加保护碱基（GCG);从dtsRl*的起始密码子开始的 已替换180bp (相当于60个密码子）的DNA片段的下游取lOOObp的dtsRl*基因序列，在 lOOObp的dtsRl*基因序列后添加 Hind III限制性内切酶识别序列（AAGCTT)，在该Hind III限制性内切酶识别序列后添加保护碱基（CGC)，获得待合成的Λ dtsRl: : dtsRl*基因序 列（SEQ ID No :3);
[0048] (4)对Λ dtsRl: : dtsRl*基因序列进行人工合成；
[0049] (5)对合成的Δ dtsRl: : dtsRl*基因序列进行Xba I和Hind III双酶切， 分别切除5'端6bp和3'端6bp序列，形成两端带有Xba I和Hind III酶切位点 粘性末端的线性DNA序列Δ dtsRl: : dtsRl*-;对pK18mobsacB质粒进行Xba I和 Hind III双酶切，使pK18mobsacB形成两端带有Xba I和Hind III酶切位点粘性 末端的线性DNA质粒载体pK18mobsacB-，将带有Xba I和Hind III酶切位点粘性 末端的线性DNA序列Δ dtsRl: : dtsRl*-与pK18mobsacB_质粒进行连接反应，得到 pK18mobsacB_ Δ dtsRl: : dtsRl* 质粒；
[0050] 其中，对合成的Λ dtsRl:: dtsRl*基因序列进行Xba I和Hind III双酶切的体系 为：XbaI，1 μ L ;Hind III，lyL;10XM Buffer，2 μ L ; Λ dtsRl: : dtsRl*DNA，彡 1 μ g ; ddH202 加至反应体系为20 μ L。反应过程为将装载上述20 μ L反应体系的EP管，置于37°C水浴锅 中进行酶切lh。
[0051] 对 pK18mobsacB 质粒进打 Xba I 和 Hind III 双酶切的体系为：Xba I，1 μ L ;Hind III，1 μ L ;10XM Buffer，2y L ;pK18mobsacB质粒，彡 1 μ g ;ddH202 加至反应体系为 20μ L。 反应过程为将装载上述20 μ L反应体系的EP管，置于37°C水浴锅中进行酶切lh。
[0052] 连接反应的体系为：Δ dtsRl: : dtsRl*DNA，7 μ L ;pK18mobsacB，1 μ L ; 10XT4DNALigation Buffer，1 μ L ;T4DNA Ligase，1 μ L，过程为在 16°C下连接过夜。
[0053] (6)采用电击转化法将pK18mobsacB_ Δ dtsRl: : dtsRl*质粒导入到谷氨酸棒杆菌 ATCC1