改善药代动力学的具有跨pH范围差异结合的抗TFPI抗体变体的制作方法
【专利说明】改善药代动力学的具有跨pH范围差异结合的抗TFPI抗体变体
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求享有于2013年3月15日提交的美国临时申请号61/798,261的权益，所 述申请通过引用并入本文。
【背景技术】
[0003] 目前的血友病A和B患者的预防性管理是替代FVIII或FIX(重组的或血浆衍生的产 品）。这些治疗每周施用两次或三次，为遵守其预防方案给患者造成了沉重负担。尽管严格 管理和严格坚持，患者通常会经历偶发的突破性出血(breakthrough bleed)并需要按需治 疗。如果没有适当的管理，频繁和严重出血导致显著发病率，特别是血友病性关节病 (hemarthropathy)。尽管用于治疗血友病A和B患者的现有药物有确切疗效，大多数青年、青 少年和老年人决定通过减少在常规基础上采取的注射次数来减轻预防负担。该做法进一步 损害了对充分管理出血所需的保护。
[0004] 因此，显著提供保护并需要相对不频繁施用的试剂是最期望的。最优的治疗应通 过每周或较少频繁的给药提供保护。鉴于目前的竞争环境，静脉内地（i.v.)或皮下地 (s. c.)施用的每周一次的治疗可在接下来的3-4年内实现。因此，i . v.或s. c.施用的试剂应 提供具有相当保护的优秀施用概况。在可以实现皮下施用的事件中，由于该方法减少的侵 入性，每周一次给药还可以对未来治疗前景提供显著的价值。
[0005]目前血友病治疗的另一个主要问题是针对因子VIII或因子IX的抑制性抗体的开 发。约25%的FVIII治疗的患者产生针对FVIII的抑制剂或中和抗体。虽然较不频繁，也在 FIX治疗的患者中发现了抑制剂。抑制剂的发展显著地降低替代治疗的有效性并对用于在 血友病患者中管理出血提出了挑战。目前对具有对FVIII或FIX抑制剂的患者的出血的治疗 是使用重组因子Vila或血浆衍生的FEIBA的旁路治疗(bypass therapy) jFVIIa的半衰期 相当短（-2小时）且因此在这些患者的预防性治疗是不常见的[Blanchette，Haemophilia 16 (supplement 3):46-51，2010]〇
[0006] 为了解决这些未被满足的医疗需求，已开发了作为长效剂针对组织因子途径抑制 物（TFPI)的抗体。见WO 2010/017196;W0 2011/109452;W0 2012/135671JFPI是启动凝血 途径的组织因子的主要抑制剂，其在血友病患者(Persons with Hemophilia，PWH)中是完 整的，并因此抑制TFPI可以在展示对FVIII或FIX的抑制性抗体的PWH中恢复止血。除了允许 达到该目标，单克隆抗体(mAb)疗法的治疗剂已显示比重组置换替代因子具有显著更长的 循环半衰期（长达3周）。抑制TFPI的抗体还具有随皮下注射的显著生物利用度。因此，抗 TFPI单克隆抗体治疗将满足对PWH和具有抑制剂的PWH的皮下注射的、长效止血保护的重要 的未满足的医学需求。
[0007] 然而，虽然TFPI的抑制在血友病血浆和血友病动物中已显示出促进凝血，由于称 为革巴介导药物处置(target mediated drug disposition)(TMDD)的现象（由于抗体与迅速 清除的靶的相互作用将抗体从循环中移除，或由于其与靶的共定位(抗体:抗原复合物)而 从血浆中隔绝的过程），针对TFPI的抗体具有相对短的、非线性的半衰期。因此，避免TFPI介 导的TMDD并且具有延长的半衰期的抗体会导致较不频繁的给药且减少每剂量所需要的材 料量。另外，较少剂量的要求还使得给药量成为限制步骤的皮下注射给药变得可行。例如， 在非人灵长类动物中，优化的抗TFPI抗体2A8-g200(W0 2011/109452)在当以5mg/kg给药时 具有28小时的半衰期，当以20mg/kg给药时具有67小时的半衰期。
[0008] 这种相对短的半衰期、和为克服TMDD的较大剂量的需要增加了患者的注射负担， 限制了用于皮下注射给药的制剂，并增加了产品的成本。在非人灵长类动物中的这些抗体 的药代动力学分析证实循环半衰期不随剂量呈线性关系，且特别在较低剂量下，其短于抗 体药物特征。类似的药代动力学概况在对于另一个抗TFPI抗体的US2011/0318356 A1中描 述。这种在较低剂量下具有显著缩短的T1/2的差异是TMDD的特征，其中在较高剂量下的较 慢的清除是由于靶的饱和。
[0009] 因此，存在对用于中度至重度血友病A和B(特别地对具有针对FVIII或FIX抑制剂 的那些患者）的更好的预防性治疗的未满足的医学需求。该需求将通过可以静脉内地或皮 下地，并且以较低频率，优选地每周一次或更少的施用的具有改善特征的抗-TFPI抗体满 足。
[0010] 发明概述
[0011] 为了增加抗TFPI抗体的半衰期和减小注射负担，生产出无效力损失的更长效的抗 TFPI抗体，且经测试以确认相比其它已证明具有TFPI结合特征且被证明对治疗凝血缺陷有 效的抗TFPI抗体具有改善的性能。（见W0 2011/109452)。特别地，通过生成在PH 6.0下相对 于在pH 7.4下具有减少的亲和力的变体抗TFPI抗体减少了TMDD。通过参与TFPI清除的受 体，可以将抗TFPI抗体与其靶(TFPI)复合，一同被细胞摄取。由Narita等人(JBC270(42): 24800-4,1995)鉴定的一种受体为LRP(LDL受体相关蛋白），其靶向TFPI以将其在核内体中 降解。然而，如果该抗原:抗体复合物可在低pH值下（其是核内体的特征)被破坏，所述抗体 可以通过FcRn结合再循环，从而增加在循环中的暴露。该原理已通过Chapparo-Riggers等 人JBC 287(14) :110-7(2012)对针对PSCK9的抗体显示。
[0012] -种在较低pH下破坏抗原:抗体复合物的方法是取代邻近抗原:抗体相互作用表 面的组氨酸残基。氨基酸组氨酸(His)在接近pH 6.0的低pH值下被质子化，且因此在pH 7.4 下为中性的残基在pH 6.0下获得正电荷。这可以导致在抗原：抗体相互作用表面上与其它 氨基酸的电荷排斥和期望程度的破坏或不稳定。
[0013] 为了鉴定pH敏感残基，将参与抗TFPI抗体(例如2A8-g200)对TFPI抗原的抗原：抗 体结合的⑶R氨基酸和其它氨基酸个别地变为His。个别的His变体证明了在pH 7.4与pH 6.0下的差异结合，且具有差异结合的变体的组合已被测试用于优化。
[0014] 经核内体释放后，这些pH敏感的抗TFPI mAb变体结合至初生的FcRN受体并再循环 至血浆。因此，pH敏感的TFPI -结合位点与在低pH下对FcRN有增加的亲和力的Fc域之间的组 合会具有协同效应，其增加了半衰期、降低了患者的注射负担，并且降低了产品成本。
[0015] 附图描述
[0016]图1显示了2A8-g200和适合于组氨酸取代的突变的抗TFPI mAb的氨基酸序列的对 比（这些序列的SEQ ID N0可在表1中找到hA.可变重链，B.可变轻链。指示了⑶R区1-3。 [0017] 图2显示了 2A8-g200Fab组氨酸扫描文库的合成和亚克隆。用虚线指示⑶R 1-3区。 带下划线的氨基酸残基指示了与TFPI接触的残基的位置。星号（*)指示提出的His突变位 点。A) 2A8-g200 重链;B) 2A8-g200 轻链;C) 4B7-gB9 · 7 重链；和 D) 4B7-gB9 · 7 轻链。
[0018]图3显示了具有示例性的组氨酸突变:A.L-L27H和B.L-Y31H的改善的抗体在两个 pH值下的解离常数。使用表面等离子体共振(Biacore T200)以测量抗体的解离速率。
[0019]图4显示了在HemA小鼠血浆中对以2mg/kg的浓度的数种单克隆抗体随时间观察到 的pK概况：2A8-g200( - ·--)、组氨酸取代的单克隆抗体TPP2256(L-Y31H/Y49H)(--- ---)和TPP2259(L-Y31H)(-A-)。抗体的药代动力学参数在对HemA小鼠以2mg/kg的静脉 内（i.v.)推注施用后确定。
[0020] 发明详述
[0021] 如本文所用的术语"组织因子途径抑制剂"或"TFPI"指的是由细胞天然表达的人 TFPI的任何变体、同种型和物种同系物。在本发明优选的实施方案中，本发明抗体与TFPI的 结合减少了血液凝结时间。
[0022] 如本文所使用的，"抗体"是指完整抗体及其任何抗原结合片段（8卩"抗原结合部 分"）或单链。术语包括全长免疫球蛋白分子(例如IgG抗体），其是天然存在的或由正常免疫 球蛋白基因片段重组处理形成，或是免疫球蛋白分子的免疫活性部分，诸如抗体片段，其保 留了特异结合活性。无论结构如何，抗体片段与通过全长抗体识别的相同抗原结合。例如， 抗TFPI单克隆抗体片段结合TFPI的表位。抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执 行。包括在抗体的术语"抗原结合部分"中的结合片段