：18.3)，(：-10〇77.1)和(：-7(5〇35.9)的相关性验证了上述推 论。R0ESY谱中Η-3β与Me-12和Η-6β，Μθ-12与Η-6β，以及Η-6β与Me-15的相关性表明Me-12和 Me-15为β构型；H-4与H-5和Me-14，Me-14与H-5和Η-9α，以及9α与H-7交叉峰表明H-4，H-5，H-7和Me-14为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可 基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ΕΟ)试验确定，理论值与实验值基本一 致(图2)。
[0026]实施例2:化合物(I)药理作用试验[0027]一、材料和仪器
[0028]人脐静脉内皮细胞珠(HUVEC)由上海午立生物技术有限公司细胞库提供。化合物(I)自制，HPLC归一化纯度大于98%jPMI-1640培养基、ΜΤΤ、二甲基亚砜均购于Sigma公司。 胎牛血清购于HyCLone公司。FITC标记羊抗兔IgG、兔抗人第八因子相关抗原购于北京博奥 森生物技术有限公司。MDA含量检测试剂盒购于南京建成生物研究所。AnnexinV-FITC凋亡 检测试剂盒购于Centrebio公司。乙二胺四乙酸(EDTA)购于广州威佳科技有限公司。
[0029]DK-8AD型电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司），ER_120A型电子分析天平 (岛津公司），6219型电子pH计（上海任氏电子有限公司），高速低温离心机（Sigma公司）， L420台式低速自动平衡离心机(湘仪离心机仪器有限公司），SYC-2101水平摇床(其林贝尔 仪器制造有限公司），l〇〇〇yL微量加样枪X1支、20-100yL微量加样枪X1支、l-20yL微量加 样枪X1支(法国吉而森公司），C〇2(培养箱Heraeus公司），超净台（苏净集团安泰公司），倒 置相差显微镜(德国莱卡公司），酶标仪(Sigma公司），FACSCaLibur(流式细胞仪）。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、脐静脉内皮细胞的培养
[0032] 1.1培养条件
[0033] 将新购入的HUVEC细胞株接种于含10%胎牛血清的1^11-1640培养基。置于37°(3， 5 %C02培养箱中，每2天更换1次培养基。
[0034] 1.2细胞传代
[0035] 取一瓶HUVEC在倒置相差显微镜下观察细胞，如长成致密的单层，即可进行传代； 将培养瓶轻轻摇动数次，悬浮起浮在细胞表面的碎片，然后连培养液一起倒出，吸取2~3mL PBS液加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，重复3次;加入lmL0.25 %胰酶，以能覆盖瓶底为限， 转动培养瓶，使湿润整个细胞层，置37°C孵育箱内消化2~3min，待确认细胞己收缩变圆时 为止;加lmL培养液于培养瓶中终止消化，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之 从瓶壁脱离形成细胞悬液，注入离心管离心(800r/min，5min)后弃去上清液;加入3mL培养 液于离心管中，用吸管吸取培养液轻轻吹打数次，使细胞悬重，然后按1:3或1:4分配传代培 养;置于孵育箱内37°C、5%C(Vg温箱中培养，24h后换液，通常3-4天可形成单层，此时便可 换维持液供实验用。
[0036] 1.3HUVEC的计数
[0037]首先取待测的细胞悬液50yL滴入细胞计数板内，按白细胞计数法，于低倍镜下计 数4角的4个大方格内的细胞总数，然后用以下公式计算细胞浓度:4个大方格内的活细胞 数/4X104=细胞数/mL [0038] 2、脐静脉内皮细胞的鉴定
[0039]在6孔培养板内放置无菌盖玻片1cmX1cm，将内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待内 皮细胞长至汇合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗盖玻片，放入100%丙酮中固定15min，用 PBS冲洗3次，每次2min，滴加3 %的H2〇2室温孵育8min，PBS冲洗3次，每次2min，滴加兔抗人硼 因子单克隆抗体（1:100)，另一盖玻片上不加一抗作阴性对照4°C过夜。次日，用PBS冲洗3 次，每次2min，滴加FITC标一记的羊抗兔IgG，37°C孵育60min，用PBS冲洗3次，每次2min，荧 光显微镜下观察并拍照。
[0040] 3、利用MTT比色法测定HUVEC的细胞活性
[0041 ] 3.1利用MTT比色法观察不同浓化合物（I)对脐静脉内皮细胞活性的影响
[0042] 3.1.1传代培养
[0043] 将HUVEC按2X104/mL的密度用含10%FBS的RPMI-1640培养基接种于96孔板，每孔 种植200yL。
[0044] 3.1.2分组加药
[0045] 传代细胞培养24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为 6组:对照组（contro1)，化合物（I) 5yg/mL组，化合物（I) 1Oyg/mL组，化合物（I) 20yg/mL组， 化合物（I)40yg/mL组，化合物（I)80yg/mL组，每孔6孔。继续培养48小时后，MTT法检测细胞 活性。
[0046] 3.1.3MTT法检测
[0047] 直接向每孔加入20yL己配制好的MTT溶液，37°C孵育4h，吸净上清，然后加入150yL DMSO。待结晶充分溶解后，利用酶标仪在波长490nm处测定0D值。
[0048] 3.2利用MTT比色法观察不同浓度ox-LDL对脐静脉内皮细胞活性的影响
[0049] 3.2.1传代培养：同上。
[0050] 3.2.2分组加药
[00511 细胞培养24h后，用含10%FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6组： 对照组（control)，ox_LDL(为自制）10yg/mL组，οχ-LDL20yg/mL组，οχ-LDL40yg/mL组，οχ-LDL80yg/mL组，ox-LDL160yg/mL组，每孔6孔。继续培养24小时，MTT法检测细胞活性。[0052] 3.3利用MTT比色法观察化合物（I)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞损伤的干预作用
[0053] 3.3.1传代培养：同上。
[0054] 3.3.2分组加药
[0055] 细胞培养24h后，用10 %FBS的RPMI-1640培养基配制药物，将细胞随机分为6组:对 照组（contro1 )，ox-LDL50yg/mL组，ox-LDL50yg/mL+化合物（I) 5yg/mL组，ox_LDL50yg/mL+化合物（I)l〇yg/mL组，ox-LDL50yg/mL+化合物（I)20yg/mL每孔6孔。继续培养24小时后， MTT法检测细胞活性。
[0056] 4、利用流式细胞技术观察化合物(I)对ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞凋亡的干预作
[0057] 4.1用传代培养
[0058] 将HUVEC按2X105/mL的密度用含10%FBS的RPMI-1640培养基接种于6孔板，每孔 种植 1500yL。
[0059] 4.2分组加药
[0060]细胞培养24h后，以RPMI-1640无血清培养基血清剥夺24h，使细胞进入静止状态。 用含RPML-1640血清培养基配制药物，将细胞随机分为5组:对照组(control)，ox-LDL50μ g/mL组，ox-LDL50yg/mL+化合物（I) 5yg/mL组，ox-LDL50yg/mL+化合物（I) 10yg/mL组，οχ-LDL50yg/mL+化合物（I) 20yg/mL每孔加lmL含药培养基。
[0061] 4.3操作步骤
[0062] 加药后12h取材，把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细 胞消化液消化细胞。细胞消化下来后，转移到离心管内，PBS洗三次（1000g离心10分钟）。加 入20(^结合缓冲液，重悬细胞。加入1(^1^111^^1^411'(：、1(^1^1染色液轻轻混匀。室温避 光孵育15分钟，30分钟内上机检测细胞凋亡。
[0063] 5、统计学分析
[0064]采用SPSS13.0统计一软件进行分析，结果表示为：均数士标准差（i±S)。方差齐 时，两组比较采用LSD，如多组与对照组比较使用Dunnett检验，当方差不齐时，采用WeLch稳 健估计，再采用T3方法两两比较。P〈0.05表示有统计学意义。
[0065]三、结果及结论
[0066] 1、不同浓度化合物(I)对HUVEC细胞