一种转换酵母交配型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种转换酵母交配型的方法，尤其是涉及 一种快速转换酿酒酵母交配型的方法。
【背景技术】
[0002] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母是 与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在 现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿 酒酵母具有单倍体和双倍体两种常见生活方式。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁 殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞(酵母的优势形态)也通过简单的有丝分裂 繁殖，但在外界条件不佳时能进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配， 重新形成二倍体。它们之间的转换可通过交配（单倍体孢子融合产生双倍体）和孢子形成 (双倍体减数分裂产生单倍体孢子)来实现，而这些变化的发生则是由菌株的交配型所决 定。酿酒酵母的交配型是由位于酵母染色体m上MAT基因座控制的，MAT基因座包括两个等 位基因 MATa和ΜΑΤα，因此将酿酒酵母单倍体菌株的交配型(mating-type)分为两种:MATa和 ΜΑΤα。
[0003] 酿酒酵母MATa和MATa两种交配型的转换主要由Η0基因的产物引起的。Η0基因在自 身启动子作用下表达Ho蛋白，该蛋白会在MAT基因座处产生双链断裂，激活ΙΠ 号染色体两端 的沉默的HMLa或者HMRa基因座将自身的Υα或者Ya序列复制至MAT基因座处修补双链断裂。 在此过程中，酿酒酵母菌株的交配型发生了转换(图1)。
[0004] 大多数实验室菌株的H0基因己积累了很多突变或者进行了基因失活处理，故不能 自发的发生交配型的转换过程，而交配型的相互转化却是酵母研究的重要手段。
[0005] 交配型转换的传统方法为将载有H0基因的质粒转化到这些细胞中，诱使这些细胞 发生交配型的转换。不过利用H0基因诱导酿酒酵母细胞交配型的转换后，异种交配型细胞 会立刻相互接触从而产生二倍体细胞，因此还需要进行生孢实验来获得单倍体菌株，实验 周期较长。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题提供一种快速转换酿酒酵母交 配型的方法。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导 入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。
[0009] 其中，本发明所述转换酵母交配型的方法具体操作为将酿酒酵母感受态细胞与转 化体系混合进行酵母转化，然后筛选，分纯；其中所述酿酒酵母感受态细胞为包含PRS415+ Cas9质粒的酿酒酵母菌株，所述转化体系包含质粒DNA，所述质粒DNA包括guide-RNA质粒和 限制性内切酶Ns i I消化的MAT基因表达盒质粒片段。
[0010]优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述感受态细胞的制备方法为挑取 携带pRS415+Cas9质粒的酵母菌株单菌落于SC-Leu液体培养基中，30°C过夜培养，然后接种 过夜培养液到YPD中30°C、220rpm条件下培养至0D 6QQ达到0.5，离心，收集细胞；用0.1M LiOAc重悬细胞，离心，吸除部分上清，剩余的LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。 [0011] 在一些实施方案中，所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4741 感受态细胞。
[0012]在另一些实施方案中，所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株 BY4742感受态细胞。
[0013]优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述guide-RNA质粒的构建方法包 括以下步骤：
[0014] a)选择guide-RNA质粒的protospacer，并合成引物；
[0015] b)退火粘合两个引物，得到双链DNA
[0016] c)限制性内切酶Notl和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
[0017] d)Gibson组装将pRS426+SNR52p-gRNA线性化质粒和双链DNA进行组装；
[0018] e)转化大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培养12h，挑取单菌落 接种于LB+Carb液体培养基中，37°C过夜培养后，提取质粒测序鉴定。
[0019] 在一些实施方案中，所述guide-RNA质粒为pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
[0020] 其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的protospacer如SEQ ID NO: 1所示。
[0021] 所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的引物如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示。
[0022] 在另一些实施方案中，所述guide-RNA质粒为pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
[0023] 其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA·MATa质粒的protospacer如SEQIDN0:4所示。
[0024] 所述pRS426+SNR52P-gRNA·MATα质粒的引物如SEQIDN0:5和SEQIDN0:6所示。
[0025] 优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述限制性内切酶Nsil消化的MAT 基因表达盒质粒的构建方法包括以下步骤：
[0026] a)合成引物：
[0027] b)以酿酒酵母基因组为模板，使用Thermo Scientific Phusi〇n?高保真DNA聚合 酶进行PCR获得DNA片段ΜΑΤα表达盒，电泳回收；
[0028] c)利用平末端质粒克隆，将ΜΑΤα表达盒连接到pTOPO平末端载体上，大肠杆菌转化 后涂布于LB+Kan平板上，37°C过夜培养；
[0029] d)挑取单菌落接种于LB+Carb液体培养基中，37°C过夜培养后，提取质粒，提取质 粒测序鉴定；
[0030] e)限制性内切酶Ns i I消化的MAT基因表达盒质粒。
[0031] 在一些实施方案中，所述MAT基因表达盒质粒为ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα。
[0032] 在另一些实施方案中，所述MAT基因表达盒质粒为pT0P0+MATa。
[0033] 其中，所述MAT基因表达盒质粒的引物如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0034] 所述ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα质粒的模板为酿酒酵母BY4742基因组。
[0035] 所述ρΤΟΡΟ+MATa质粒的模板为酿酒酵母ΒΥ4741基因组。
[0036]本发明所述转换酵母交配型的方法所述转化体系中所述质粒DNA组成为每150yL 中含50ng guide-RNA质粒和5yL MAT基因表达盒质粒，余量为水。
[0037] 进一步的，所述转化体系还包括50%PEG3350、1M LiOAc和10mg/mL ssDNA。
[0038] 其中50%PEG3350、lMLi0Ac、10mg/mLssDNA和质粒DNA的体积比为62:9:4:15。
[0039] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白 在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母 交配型。本发明所述转换酵母交配型的方法可高效、快速转换酿酒酵母单倍体交配型，不依 赖酿酒酵母自身染色体结构HMLa和HMRa，无需经过二倍体酿酒酵母阶段，且无需对待转换 酿酒酵母菌株进行诱导等处理，直接获得相反交配型酿酒酵母菌株，实验周期短。
【附图说明】
[0040] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0041 ]图1示基于H0基因转换酿酒酵母交配型方法示意图；
[0042]图2示本发明所述转换酵母交配型方法的示意图；
[0043]图3示实施例1将酿酒酵母菌株BY4741交配型转换为ΜΑΤα的效率统计图；
[0044]图4示实施例2将酿酒酵母菌株ΒΥ4742交配型转换为MATa的效率统计图。
【具体实施方式】
[0045] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0046] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0047] 一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导 入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。
[0048]本发明所述转换酵母交配型的方法利用Cas9蛋白取代Ho蛋白在MAT基因座处产生 双链断裂，并利用外源导入的MAT片段对双链断裂进行修补，对酿酒酵母交配型进行转换， 具体如图2所示。
[0049] 其中，本发明所述转换酵母交配型的方法具体操作为将酿酒酵母感受态细胞与转 化体系混合进行酵母转化，然后筛选，分纯；其中所述酿酒酵母感受态细胞为包含PRS415+ Cas9质粒的酿酒酵