CaCl2,重悬细胞，静置5min;离心吸出上清。
[0096] 本发明所述转换酵母交配型的方法在转化后对细胞进行筛选。所述筛选可以按照 本领域公知的方法进行。
[0097]在一些实施方案中，所述筛选具体为无菌水中重悬细胞涂布SC-Leu-Ura培养板进 行筛选。其中所述SC-Leu-Ura培养板为缺省亮氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基平板。SC-Leu-Ura培养基具体配制方法为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺省亮氨酸和尿嘧 啶的混合氨基酸粉末2g/L，2 %琼脂粉。
[0098]本发明所述转换酵母交配型的方法在筛选后还可以进一步在SC-Leu-Ura培养板 上对筛选获得的单菌落进行划线分纯。
[0099] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白 在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母 交配型。本发明所述转换酵母交配型的方法可高效、快速转换酿酒酵母单倍体交配型，不依 赖酿酒酵母自身染色体结构HMLa和HMRa，无需经过二倍体酿酒酵母阶段，且无需对待转换 酿酒酵母菌株进行诱导等处理，直接获得相反交配型酿酒酵母菌株，实验周期短。
[0100] 为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊 说明，本发明所述质粒、载体等均可通过商业渠道购买得到。如pTOPO平末端载体为商业载 体pCR-Blunt II-TOPO vector(Invitrogen/Life 了6。1111。1。8168,45-〇245)。卩1^426+ SNR52p-gRNA是根据商业化载体Addgene plasmid#43802改造而来。
[0101] 实施例1
[0102] 利用基于CRISPR/Cas9技术的酿酒酵母交配型转换技术，对酿酒酵母BY4741进行 交配型转换，包括以下步骤：
[0103] 1、利用LiOAc转化法将携带Cas9基因的质粒pRS415+Cas9转化入酿酒酵母菌株 BY4741中，转化后的细胞涂布于SC-Leu平板上进行筛选，30°C培养2天。挑取单克隆转化子 在SC-Leu平板上划线分纯，备用。
[0104] 2、构建靶位点为MATa的guide-RNA质粒，其构建步骤如下：
[0105] a)选择 protospacer 为acaaaaatatttctaacaat;
[0106] b)合成弓丨物："GCAGTGAAAGATAAATGATCacaaaaatatttctaacaatGTTTTA GAGCTAGAAATAGC，，和 "GCTATTTCTAGCTCTAAAACattgttagaaatatttttgtGA TCATTTATCTTTCACTGC";
[0107] c)退火粘合两个引物，得到双链DNA;
[0108] d)利用限制性内切酶Notl和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
[0109] e)利用Gibson组装将线性化质粒和双链DNA进行组装；
[0110] f)将反应体系转化如DH5a大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培 养 12h;
[0111] g)挑取5个单菌落接种于5mL LB+Carb液体培养基中，37°C过夜培养后，提取质粒， 进行Sanger测序；
[0112] h)测序正确的质粒命名为 pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
[0113] 3、构建ΜΑΤα表达盒质粒，其构建步骤如下：
[0114] a)合成引物：
[0115] MAT-amp1i fy-F：ACGATAACTGGTTGGAAAGCGTAA
[0116] MAT-amp1i fy-R：AGACTTGTGGCGAAGATGAATAGT；
[0117] b)以酿酒酵母BY4742基因组为模板，使用Thermo Scientif icPhusi〇nx高保真 DNA聚合酶进行PCR获得DNA片段ΜΑΤα表达盒，并进行琼脂糖电泳回收，目标片段长度为 3398bp；
[0118] c)利用平末端质粒克隆，将ΜΑΤα表达盒连接到pTOPO平末端载体上，大肠杆菌DH5a 转化后涂布于LB+Kan平板上，37°C过夜培养；
[0119] d)挑取3个单菌落接种于5mL LB+Carb液体培养基中，37°C过夜培养后，提取质粒， 进行Sanger测序；
[0120] e)测序正确的质粒命名为ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα。
[0121] 4、利用限制性内切酶Nsil对质粒ρΤ0Ρ0+ΜΑΤα进行消化。
[0122] 5、酿酒酵母转化，其步骤如下：
[0123] a)挑取携带pRS415+Cas9质粒的ΒΥ4741单菌落于5mL SC-Leu液体培养基中，30°C 过夜培养；
[0124] b)测量过夜培养的酿酒酵母培养液0D6QQ，接种过夜培养液到5mL YPD液体培养基 中（0 · 1250D6(x)/mL)，30°C、220rpm条件下培养至0D6QQ达到0 · 5(约需要3 · 5h-4.5h);
[0125] c)吸取1.5mL步骤b)得到的酿酒酵母培养液至1.5mL EP管内，5000rpm离心lmin， 收集细胞；用lmL无菌水重悬细胞，同上离心，收集细胞；用lmL 0.1M LiOAc重悬细胞，同上 离心，收集细胞；用移液器吸除900yL上清，剩余的100yL LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感 受态细胞。
[0126] d)准备转化体系，其中质粒DNA为pRS426+SNR52p-gRNA · MATa，50ng; ρΤΟΡΟ+ΜΑΤα酶 切体系，5yL，加水补至150yL:
[0127] 成分体积(yL) 50%PEG3350 620 1 MLiOAc 90
[0128] ssDNA(10mg/mL) 40 质粒DNA 150
[0129] e)将lOOyL感受态细胞中加入至转化体系中，吹吸均匀，最高速涡旋10s; 30°C培养 箱中孵育30min;加入90yL DMSO，涡旋震荡10s ; 42°C热激15min; 3600rpm离心30s，收集细 胞；吸出上请，加入400yL 5mM CaCl2，重悬细胞，静置5min; 3600rpm离心30s，吸出上请，在 无菌水中重悬后涂布SC-Leu-Ura筛选培养板筛选。
[0130] 6、待酵母在筛选培养板上生长2天，挑取单菌落于SC-Leu-Ura平板上划线分纯。
[0131 ] 7、利用酵母菌落PCR方法验证分纯后的菌株交配型（Huxley，C.，et al .Trends Genet(1990)，6,236)，统计酿酒酵母菌株BY4741交配型转换为ΜΑΤα的效率结果见图3。随后 挑选ΜΑΤα交配型的菌株进行保存，命名为ΒΥ4741 -ΜΑΤα。
[0132] 结果显示利用在对ΒΥ4741进行交配型转换时，分别挑选96的转化子进行交配型的 验证。对照组(转化PRS426质粒或者转化pRS426质粒和ρΤΟΡΟ+ΜΑΤα酶切DNA片段)基本保持 原交配型（100%和94.79%)，并未能获得转换交配型的单倍体酵母菌株。对照组（转化 pRS426+SNR52p-gRNA. MATa质粒）中有9.38 %的菌株转换交配型至ΜΑΤα的单倍体菌株，其余 为二倍体菌株，说明所选择的Cas9蛋白替代了Ho蛋白的功能，在对酵母菌株MATa表达盒进 行切割后导致HMLa对双链断裂进行修复，同时转换了酵母菌株的交配型。实验组（转化 pRS426+SNR52p-gRNA. MATa质粒和ρΤΟΡΟ+ΜΑΤα酶切DNA片段)利用本发明方法对酵母菌株进 行交配型的转换，筛选得到的交配型转换后的单倍体酵母菌株比例为26.04%，明显高于对 照组，说明本发明所述方法可以有效转换酿酒酵母交配型。
[0133] 实施例2
[0134] 利用基于CRISPR/Cas9技术的酿酒酵母交配型转换技术，对酿酒酵母ΒΥ4742进行 交配型转换，包括以下步骤：
[0135] 1、利用LiOAC转化法将携带Cas9基因的质粒pRS415+Cas9转化入酿酒酵母菌株 BY4742中，转化后的细胞涂布于SC-Leu平板上进行筛选，30°C培养2天。挑取单克隆转化子 在SC-Leu平板上划线分纯，备用。
[0136] 2、构建靶位点为ΜΑΤα的guide-RNA质粒，其构建步骤如下：
[0137] a)izfei$protospacer^caaatcatacagaaacacag；
[0138] b)合成引物：
[0139] "GCAGTGAAAGATAAATGATCcaaatcatacagaaacacagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC'，和
[0140] "GCTATTTCTAGCTCTAAAACctgtgtttctgtatgatttgGATCATTTATCTTTCACTGC";
[0141] c)退火粘合两个引物，得到双链DNA;
[0142] d)利用限制性内切酶Notl和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
[0143] e)利用Gibson组装将线性化质粒和双链DNA进行组装；
[0144] f)将反应体系转化如DH5a大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37°C培