利用具有产生l-赖氨酸能力的微生物产生l-赖氨酸的方法
【专利说明】利用具有产生L-赖氨酸能力的微生物产生L-赖氨酸的方法
[0001 ]本申请是分案申请，原申请的申请日为2 0 1 2年1 2月2 1日、申请号为 201280070290.6、发明名称为"利用具有产生L-赖氨酸能力的微生物产生L-赖氨酸的方 法"。
[0002] 发明背景 1.发明领域
[0003] 本发明涉及修饰的多核苷酸--其中起始密码子用ATG替代;包括其的载体;包括 该多核苷酸的微生物;和利用其产生L-赖氨酸的方法。
[0004] 2.相关技术的描述
[0005] 棒状杆菌属的菌株，特别地谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是 广泛地用于产生L-赖氨酸的革兰氏阳性微生物。L-赖氨酸用于动物饲料、人的药物和化妆 品，并通过棒状杆菌菌株的发酵产生。
[0006] 常规地，具有提高的赖氨酸生物合成基因的棒状杆菌属的菌株和利用其产生L-赖 氨酸的方法是已知的。例如，美国专利号6,746,855公开了通过培养具有增强的lysE基因 (赖氨酸输出载体基因 ，lysine export carrier gene)表达、并且另外引入选自dapA基因、 lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因的棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。
[0007] 另一个方法是扩增关于赖氨酸生物合成途径的基因以修饰启动子。例如，韩国专 利申请特许公开号2009-0082702和2009-0084099公开了通过将改进的ddh启动子和lysC-asd操纵子引入棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。韩国专利申请特许公开号2008-0025355 公开了通过增加染色体中关于赖氨酸生物合成途径的基因--其是aspB、lysC、asd、dapA、 dapB、lysA和pyc--的拷贝数而提高赖氨酸生产力的方法。
[0008] 同时，由核糖体识别以启动染色体中翻译的起始密码子通常是ATG。翻译可根据基 因的起始密码子而被控制，并且起始密码子的序列在蛋白质活性的调节中是重要的。然而， 虽然ATG是源自谷氨酸棒状杆菌的赖氨酸生物合成基因中通常的起始密码子，但是lysC和 pyc基因的起始密码子是GTG，并且TTG用于戊糖磷酸盐途径上的tkt基因，其含有起始密码 子TTG(参考：J.Biotechnol. ,104:5-
[0009] 本发明人已作出许多努力来找到提高赖氨酸生产力的方法，结果，他们发现野生 型lysC、tkt和pyc基因的起始密码子可用ATG替代以提高天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸 羧化酶相对于其内源活性的活性，由此完成本发明。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明的目的是提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4;在下文中，称作LysC)、转酮 醇酶(EC: 2.2.1.1;在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1;在下文中，称作Pyc) 的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。
[0012] 本发明的另一个目的是提供包括一种或多种编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮 酸羧化酶的修饰的多核苷酸的载体，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。
[0013] 本发明的另一个目的是提供微生物，其中一种或多种酶具有与它们的内源活性相 比提高的活性。
[0014]本发明的另一个目的是提供产生L-赖氨酸的方法，包括培养所述微生物，和从培 养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。
[0015]发明效果
[0016] 本发明提供具有提高的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌属微生物，其中一种或多种编 码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的基因的起始密码子被替代，以与天然微生物 中它们的内源活性相比提高相应的酶活性。
[0017] 优选实施方式的详细描述
[0018] 一方面，本发明提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4;在下文中，称作LysC)、转酮 醇酶化(： :2.2.1.1;在下文中，称作了1^)或丙酮酸羧化酶化(：:6.4.1.1;在下文中，称作? 7(3) 的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子由ATG替代。
[0019] 每个编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的多核苷酸还可包括多核苷酸 中的部分替代、缺失、插入或添加，只要它们中的每个具有酶活性，和基于已知的多核苷酸 可具有70%或更多的同源性，特别地80%或更多的同源性，更特别地90%或更多的同源性， 和更特别地95%或更多的同源性，和最特别地100%同源性。
[0020] 如本文所用，术语"同源性（同源的)"指野生型的lysC基因、tkt基因或pyc基因的 核苷酸序列和其相应的修饰的基因，即，修饰的lysC基因、tkt基因或pyc基因的核苷酸序 列一一其中部分多核苷酸被替代、缺失、插入或添加一一之间的相似性程度。
[0021] 如本文所用，术语"起始密码子"指当mRNA(信使RNA)的编码序列翻译成蛋白质时 对应于翻译起始点的3个核苷酸。一般而言，微生物染色体中发现的起始密码子是ATG(mRNA 上是AUG)、GTG(mRNA上是GUG)和TTG(mRNA上是UUG)，并且根据谷氨酸棒状杆菌的全部基因 组序列的分析结果它们以62.5%~66.5%、23.1 %~24.3%和10.3%~13.2%的比率存在 (参考：Handbook of Corynebacterium glutamicum,40p ,Lothar Eggeling&Michael Bott,2005)〇
[0022] 在迄今报道的源自棒状杆菌的赖氨酸生物合成基因当中，lysC和pyc具有起始密 码子GTG，tkt具有起始密码子TTG。这些基因的起始密码子不是ATG，这被认为是棒状杆菌的 独特特性。
[0023]根据本发明的修饰的多核苷酸的特征在于lysC, tkt或pyc基因的起始密码子由 ATG替代，并且这些具有这样替代的起始密码子的修饰的多核苷酸已首先被本发明人修饰。 更详细地，在本发明中编码天冬氨酸激酶(LysC)或丙酮酸羧化酶(Pyc)的多核苷酸的GTG起 始密码子由ATG替代，编码转酮醇酶(Tkt)的多核苷酸的TTG起始密码子由ATG替代。更具体 地，lysC、tkt和pyc基因的序列分别是SEQ ID N0s.l3、14和15,具有的替代起始密码子为 ATG的基因序列分别由SEQ ID N0s.l6、17和18表示。
[0024] 起始密码子的碱基替代可通过本领域已知的任何方法来进行，例如，位点专一诱 变、同源重组，但不限于此。
[0025] 另一方面，本发明提供这样的载体，其包括编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸 羧化酶的修饰的多核苷酸中的一种或多种修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子由 ATG替代。
[0026] 具有的替代起始密码子为ATG并编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的 修饰的多核苷酸一一其可包含在本发明的载体中一一可包括部分多核苷酸被替代、缺失、 插入或添加的那些多核苷酸，只要它们具有酶活性，和可具有70%或更多的同源性，特别地 80%或更多的同源性，更特别地90%或更多的同源性，更特别地95%或更多的同源性，和最 特别地100 %同源性。
[0027]进一步，具有的替代起始密码子为ATG并编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧 化酶的修饰的多核苷酸一一其可包含在本发明的载体中一一还可只包括部分的编码天冬 氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的基因，只要它们具有的替代起始密码子为ATG。
[0028]如本文所用，术语"载体"指DNA构建物，其含有可操作地连接至合适的控制序列 的碱基序列以在合适的宿主中表达靶基因。控制序列可包括启动转录的启动子、控制这种 转录的某个操纵基因序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译 终止的序列。用于本发明的载体没有特别限制，并且可以是本领域已知的任何载体，只要其 在宿主中可复制。例如，载体可以是质粒、噬菌体颗粒或潜在的基因组插入物，并且特别地 是pDZ (韩国专利号10-0924065 )，但不限于此。一旦转化进合适的宿主，载体就可独立于宿 主基因组而复制或起作用，或可整合进基因组本身。
[0029]具体地，获得包括lysC、tkt或pyc基因的起始密码子的核苷酸序列（SEQ ID NO. 13、14或15)，和基于该序列，合成具有的替代起始密码子为ATG的引物。利用引物和L-赖 氨酸-产生菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以获得DNA，其一端由ATG替代。将这样获得 的该DNA片段克隆进载体以获得最终的重组载体。更具体地，在本发明中，分别构建pDZ-lysC(ATG)、pDZ-tkt(ATG)和 pDZ-pyc(ATG)载体。
[0030] 另一方面，本发明提供包括一种或多种修饰的多核苷酸的微生物，该多核苷酸具 有的替代的起始密码子为ATG并且编码选自天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶的酶， 和然后所述酶从多核苷酸转录的mRNAs到蛋白质的翻译水平被提高，导致与其内源活性相 比一种或多种酶的活性提高。本发明的微生物可通过利用修饰的多核苷酸组合其一个、两 个或三个而具有提高的天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的活性，其中修饰的多核 苷酸编码相应的酶和在起始密码子上用ATG替代。
[0031] 为了用ATG替代微生物染色体上靶基因的起始密码子，可利用本领域已知的多种 方法。例如，微生物中内源lysC、tkt和pyc基因的起始密码子序列可在染色体上被替代。可 选地，可将相应的具有替代起始密码子序列的基因以质粒的形式引入所述微生物。
[0032] 所述微生物可以是任何菌株，只要它具有L-赖氨酸生产力。特别地它可以是棒状 杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium sp.)的微生物。棒状杆菌属或短杆菌属微生物的实施 例包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、热产氨棒状杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)ATCC 14067、发 酵乳短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869。进一步，可包括从其衍生的产 生L-赖氨酸的变体或菌株，例如，谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(该微生物被公开为 KFCC10881，和在布达佩斯条约下重新保存到国际保藏管理局，登记号KCCM11016P，韩国专 利号10-0159812,韩国专利号10-0397322)和谷氨酸棒状杆菌KFCC 11001。此外可以是谷氨 酸棒状杆菌，登记号KCCM11016P。
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