菌株的生长
[0094] 作为重组载体，利用实施例1、2和3中制备的pDZ-lysC(ATG)pDZ-tkt(ATG)pDZ-pyc (ATG)，制备过程如下。
[0095] 将pDZ-tkt(ATG)载体转化进实施例1的KCCM11016P_lysC，其中lysC的GTG起始密 码子由ATG替代，并通过第二交换，染色体上lysC和tkt的起始密码子被ATG替代以获得 KCCM11016P-lysC-tkt。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ ID N0s.5和8的引物的 PCR以及然后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
[0096]以与实施例1中相同的方式，将pDZ-pyc (ATG)载体转化进实施例1的KCCM11016P-lysC，其中lysC的GTG起始密码子由ATG替代，并通过第二交换，染色体上lysC和pyc的起始 密码子由ATG替代以获得KCCM11016P-lySC-pyc。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用 SEQ ID NOs.9和12的引物的PCR以及然后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
[0097] 将pDZ-tkt(ATG)载体转化进本实施例的KCCM11016P-lysC-pyc，其中lysC和pyc的 GTG起始密码子由ATG替代，并通过第二交换，染色体上lySC、pyc和tkt的起始密码子由ATG 替代以获得KCCM11016P-lySC-pyc-tkt。基因起始密码子的核苷酸替代通过利用SEQ ID NOs. 5和8的引物的PCR以及然后通过分析靶位点的核苷酸序列而被最后证实。
[0098]基因的上述组合仅用于说明的目的，基因组合的范围不意欲受限于此。
[0099] 实施例8:在具有替代的ATG起始密码子的菌株中产生赖氨酸
[0100] 将实施例1、2、3和7中最终制备的KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、 KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt、KCCM11016P-lysC-pyc、KCCM11016P-lysC-pyc-tkt通过以下方法培养用于L-赖氨酸产生。
[0101] 亲本株 KCCM11016P 和 KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、 KCCM11016P-lysC-tkt、KCCM11016P-lysC-pyc、KCCM11016P-lysC-pyc-tkt 接种在各自含有 25ml下面描述的种子培养基的250ml三角带挡板的烧瓶(corner-baffled flasks)中，并将 生成物在30°C以200rpm摇动培养20小时。将lmL产生的种子培养肉汤接种到含有24ml下面 描述的生产培养基的250ml三角带挡板的烧瓶中，并在30°C摇动(200rpm)培养120小时。
[0102] 完成培养之后，产生的L-赖氨酸的量通过HPLC测量。测量KCCM11016P和 KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt、 KCCM11016P-lysC-pyc、KCCM11016P-lysC-pyc-tkt的培养肉汤中L-赖氨酸的结果显示在下 面的表7中。
[0103] [表 7]
[0104]
[0105] 种子培养基(pH 7.0)
[0106] 20g粗糖、10g蛋白胨、5g of酵母抽提物、1.5g尿素、4g KH2P04、8g K2HP04、0.5g MgS〇47H2〇、100yg生物素、lOOOyg硫胺素_HCl、2000yg泛酸钙、2000yg烟碱酰胺(在1升蒸馏水 中）
[0107] 生产培养基(pH 7.0)
[0108] 100g葡萄糖、40g (NH4) 2SO4、2 · 5g大豆蛋白质、5g玉米衆固体（corn steep solids)、3g尿素 、lg KH2P04、0.5g MgS(k 7H2〇、100yg生物素、1000yg硫胺素_HCl、2000yg泛 酸钙、3000yg烟碱酰胺、30g CaC03(在1升蒸馏水中）
[0109] 如表7所示，发现与亲本株KCCM11016P相比，具有替代的ATG起始密码子的谷氨酸 棒状杆菌 KCCM11016P-lysC、KCCM11016P-tkt、KCCM11016P-pyc、KCCM11016P-lysC-tkt 和 KCCM11016P-lysC-pyc显示L-赖氨酸生产力增加4~9%。特别地，发现与亲本株1(〇1111016? 相比，引入所有三个基因的KCCM11016P-ly SC-pyc-tkt显示L-赖氨酸生产力增加高达12%。 [0110] 实施例9:lysC、tkt和pyc基因中具有替代的ATG起始密码子的KFCC10750衍生的菌 株的生长和赖氨酸生产力的比较
[0111] 为了检查lysC、pyc和tkt基因中用ATG替代起始密码子是否在属于谷氨酸棒状杆 菌的其它赖氨酸-产生菌株中影响赖氨酸生产力，将所有三个基因--其显示实施例8中最 好的增加赖氨酸生产力的效应一一引入L-赖氨酸-产生菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10750 (韩国专利号10-0073610)以制备重组菌株，将其命名为KFCC10750-lysC-pyc-tkt。将菌株 以与实施例8相同的方式培养，并分析L-赖氨酸浓度(表8)。
[0112] [表 8]
[0113]
[0114] 如表8所示，引入所有三个基因的谷氨酸棒状杆菌KFCC10750-lySC-pyc-tkt显示： 与亲本株KFCC10750相比赖氨酸生产力15%的增加。
[0115] 实施例10:lysC、tkt和pyc基因中具有替代的ATG起始密码子的KCCM10770P衍生的 菌株的生长和赖氨酸生产力的比较
[0116]将所有三个基因--其显示实施例8中最好的增加赖氨酸生产力的效应--引入 另一个L-赖氨酸-产生菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)以制备重 组菌株，将其命名为KCCM10770P-ly SC-pyc-tkt。以与实施例8相同的方式培养菌株，并分析 L-赖氨酸浓度(表9)。
[0117] [表 9]
[0118]
[0119] 如表9所示，引入所有三个基因的谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-lysC-pyc_tkt显 示:与亲本株1(01110770?相比赖氨酸生产力11%的增加。
[0120] 实施例11:178(：4杜和口7(；基因中具有替代的4了6起始密码子的(^3?衍生的菌株的 生长和赖氨酸生产力的比较
[0121]将所有三个基因--其显示实施例8中最好的增加赖氨酸生产力的效应--引入 另一个L-赖氨酸-产生菌株谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder等人，Genome Biology 2012,13: R40)以制备重组菌株，将其命名为CJ3P-lySC-pyc-tkt。以与实施例8相同的方式培养菌 株，并分析L-赖氨酸浓度(表10)。
[0122] [表 10]
[0123]
[0124]如表10所示，引入所有三个基因的谷氨酸棒状杆菌CJ3P-lysC-pyC-tkt显示:与亲 本株CJ3P相比赖氨酸生产力18 %的增加。
[0125]原始保藏接收证明
[0126] 至:CJ第一制糖株式会社
[0127] 500 5-GA NAMDAEMUN-RO,CHUNG-KU,
[0128] 大韩民国
[0129]
[0130] 证明上述翻译与原文内容没有相互违背
[0131] 2012 年 12 月21 日
[0132] 专利代理人Son Min印
[0133] 原始保藏接收证明
[0134] 至:CJ第一制糖株式会社
[0135] 500 5-GA NAMDAEMUN-RO，CHUNG-KU，
[0136] 大韩民国
[0137]
[0138] 证明上述翻译与原文内容没有相互违背
[0139] 2011 年 12 月21 日
[0140] 专利代理人Son Min印。
【主权项】
1. 编码转酮醇酶(Tkt)的修饰的多核苷酸，其中所述多核苷酸的起始密码子由ATG替 代。2.根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸，其中所述编码转酮醇酶(Tkt)的多核苷酸的 所述起始密码子是TTG。3. 根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸，其中所述修饰的多核苷酸由SEQIDNO. 17 的核苷酸序列表示。4.包括根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸的载体。5.修饰的微生物，其具有与其内源活性相比提高的转酮醇酶活性，其中编码转酮醇酶 的多核苷酸的起始密码子由ATG替代。6. 根据权利要求5所述的微生物，其具有与其内源活性相比进一步提高的丙酮酸羧化 酶活性，其中编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸的起始密码子由ATG替代。7. 根据权利要求5所述的微生物，其中用权利要求4所述的载体转化所述微生物。8. 根据权利要求5所述的微生物，其中所述微生物是棒状杆菌属。9. 根据权利要求8所述的微生物，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌。10. 产生L-赖氨酸的方法，包括培养权利要求5至9中任一项所述的微生物;和从所述培 养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。
【专利摘要】本发明涉及编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中起始密码子由ATG替代；包括其的载体；用所述载体转化的微生物；和利用其产生L-赖氨酸的方法。KCCM11016P19951218
【IPC分类】C12N15/77, C12P13/08, C12R1/15, C12N15/54, C12N1/21
【公开号】CN105483145
【申请号】CN201610009619
【发明人】李光镐, 林相曹, 文准玉, 张在佑, 朴寿真, 朴相喜
【申请人】Cj第一制糖株式会社
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2012年12月21日
【公告号】CA2860252A1, CN104334728A, CN105624175A, EP2796555A2, EP2796555A4, US20150099281, WO2013095071A2, WO2013095071A3