alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用
【专利说明】a I Pha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用
技术领域
[0001]本发明属于分析化学领域，涉及一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用。
【背景技术】
[0002]目前，针对alpha-酮戊二酸的分析化学方法主要包括气相(GC)、高效液相色谱(HPLC)与质谱(MS)、紫外检测器(UV-detector)等。而荧光分子探针检测方法数量甚少，包括利用硝基苯并噻二卩坐肼(nitrobenzothiadiazole hydrazine DT)和萘酰亚胺肼取代物(hydrazino-substituted naphthalimide)焚光分子探针对alpha-酮戊二酸进行监测。
[0003]色谱检测方法已经在很多领域得以应用，但对于临床医学生物样本的快速批量检测来说并不是最好的选择。其原因在于:首先，技术步骤复杂，样品处理步骤繁多、工作量大、操作时间长、效率低下等。这对于医学生物样本，特别是活细胞、活体检测是完全没有可能实现的。其次，样品需求量大，试剂消耗量大。生物样本的特点在于样本量微小，而色谱联合大型仪器检测的方法则往往需要预处理较大数量的待测样本来达到目标物纯化、富集、分离的目的，因此并不适用于微量样本分析。最后，大型仪器本身成本高，且操作往往步骤缜密，不易于掌握和推广，在高效率快节奏的现代社会，此类方法的应用似乎达到了发展的瓶颈期。
[0004]荧光分子探针检测主要通过设计荧光分子探针对待测物进行高度选择检测，从而产生荧光响应的改变，并利用光学信号的差异性质来对待测物进行高灵敏检测。步骤大体概括为:分子设计、样品检测等。基于荧光分子探针的检测与应用是分析技术中比较新颖的技术，其原理在于通过分子设计思想，将发光基团与反应基团连接得到分子探针。检测时，探针通过反应基团的特异性反应来识别目标物，分子结构的改变将对发光基团造成影响，使荧光信号发生改变，从而实现对目标物的检测或生物成像。从其检测原理可见此类方法优势在于选择性好，不需要待测物分离，操作简便，适于样品的批量分析。所以该方法在生命分析研究领域备受推崇。然而，对于alpha-酮戊二酸，此类方法非常少见，说明学术界目前的研究程度还远远不够。从目前所报导的两种方法来看，存在如下缺限:
首先，荧光响应差，灵敏度较低，发光原理不利于生物样本检测。从现有报导来看，现有探针与待测物alpha-酮戊二酸反应后，荧光增强约7-9倍，很难实现高灵敏检测。虽然借助添加表面活性剂的方法来实现荧光增强，但这种方法将破坏生物环境同时会带来较大的误差，因而并不适于生物样本的实际检测。因此，探针本身的分子结构设计有待改进。
[0005]其次，检测准确性、精确密等指标有待改善。众所周知，相对于大型仪器较高的信号稳定性，生物传感往往带来较大误差。虽然荧光探针的信号自校正功能可有效改善这一缺点。但现有报导并没有对这一缺点实施改善。并且现有探针分子发光原理不利于分子荧光的强烈增加。所以，探针的功能性设计及发光机理均有待改进。
[0006]再次，检测的便捷程度仍有待提高。目前，生命有机分析检测领域中涌现出很多快捷方便的检测手段，包括比色法、肉眼监测等等。这些方法已在细胞分析、活体监测等领域广为使用，但alpha-酮戊二酸的比色/肉眼观测技术却依然处于研究的空白。因此，将检测方法进一步改善，将实验操作的便捷程度继续提高是alpha-酮戊二酸检测方法开发的实际需求。
[0007]最后，缺乏对alpha-酮戊二酸成像技术的研究。细胞/组织成像技术是荧光探针优势的独特体现。该技术可实现疾病的可视化监测与治疗，对于癌症等重大疾病的发现与诊断有着非凡的意义。但前人所报导的方法中并未涉及这一技术及应用。因而，开发适于细胞成像的分子探针，建立可视化监测平台将从本质上改变alpha-酮戊二酸的研究方式，有望实现对alpha-酮戊二酸所致癌症疾病的可视化研究。因此，成像技术及应用亟待开展。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法，制备得到的分子探针可应用于生物样本检测，具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，设备便捷易操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。
[0009]本发明技术方案如下:
一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法，步骤为:将NBD-Cl (7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazole)溶解于氯仿中，溶解浓度0.002?0.012 g/mL，然后加入体积浓度为0.2?1.2%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得棕色产物alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针。
[0010]上述制备方法中，所述的NBD-Cl溶解于氯仿中溶解浓度优选0.006g/mL;水合肼-甲醇溶液体积浓度优选0.6%。
[0011]所述的alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针，检测效果指标如下:
检测灵敏度:检测限0.9pmoL/L;荧光增强倍数为20?60倍；
吸收波长改变:检测时吸收向红光移动100 nm；
颜色变化:在日光灯下颜色由淡绿色变为红色;紫外灯下的颜色由无色变为绿色； 双重定量校正:兼具荧光定量功能及吸收峰比率定量功能；
光学机理指标:兼具PET荧光开关功能及吸收红移功能。
[0012]上述alpha-酮戊二酸的焚光/紫外分子探针的应用:适用于生物样本中alpha-酮戊二酸的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷;其中生物样本主要包括血清、活细胞、肌肉组织等，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。
[0013]本发明alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针定量分析生物样本中alpha-酮戊二酸时，适用于检测血清中alpha-酮戊二酸含量。
[0014]本发明荧光/紫外分子探针检测血清中alpha-酮戊二酸含量的方法，步骤包括:
I)配制溶液
探针HNBD储备液配制:准确称取alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2 X 10—4M的探针HNK)储备液；
待测目标物alpha-酮戊二酸(α-ΚΑ)储备液配制:准确称取待测目标物alpha-酮戊二酸溶于无水乙腈，配制浓度为I X 10—3 M的alpha-酮戊二酸储备液； 血清储备液配制:将血清和无水乙腈按体积比5:1混合，转速5000 rpm离心20min，取上清液过0.2 pm膜处理得血清储备液；
2 )建立血清/a I pha-酮戊二酸标准品的线性方程
取步骤I)配制的待测目标物alpha-酮戊二酸储备液稀释得到梯度浓度为2?900μΜ的alpha-酮戊二酸标准品溶液，然后分别取200 yL稀释后2?900μΜ alpha-酮戊二酸标准品溶液与10yL探针HNBD储备液和650 血清储备液混合后，加入50 pL度为10 mM、pH7.4的PBS缓冲液，振摇混合均匀，于37 °C下放置60min，然后经荧光分光光度计和紫外光谱仪检测，建立血清/α-ΚΑ浓度与荧光信号强度的线性方程或血清/α-ΚΑ浓度与紫外吸收信号强度的线性方程；
荧光或紫外方法检测血清待测样品中alpha-酮戊二酸含量
a)荧光检测待测样品:将1001IL待测样品注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入血清/α-ΚΑ浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得alpha-酮戊二酸含量；
b)紫外检测待测样品:将1001IL待测样品注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入血清/α-ΚΑ浓度与紫外吸收信号强度，计算得alpha-酮戊二酸含量。
[0015]上述荧光/紫外分子探针检测血清中alpha-酮戊二酸含量的应用，最优检测范围为荧光3?900μπιΟ1/1，紫外80?200μπιΟ1/1。分别以荧光检测、紫外检测的方法对待测物进行平行多次检测(η=7)，并与标准品进行校准，得到荧光/紫外检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择最优化的检测手段进行定量。
[0016]本发明alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针定性分析生物样本中alpha-酮戊二酸时，适用于血清样品中alpha-酮戊二酸的肉眼监测、活细胞内alpha-酮戊二酸的监测和肌肉组织内alpha-酮戊二酸的监测