[0057]基于本探针较强的荧光响应，本发明分析了探针HNBD对α-ΚΑ的选择性，其比较对象包括葡萄糖(Glucose)、甘露糖(Galactose)、乙二醛(Glyoxal)、过氧化氢(Η-2Ο2)、丙酮酸钠(sodium pyruvate (PAS))、苯甲酰甲酸(phenylglyoxal)、丙酮酸(methylglyoxal)、苯丙酮酸(phenylpyruvic acid)来制备。探针HNBD对待测物α-ΚΑ及其他物质选择性对照实验结果如图18所示，图中其他物质包括:a图中100微摩/升的氨基酸:1: Ala 2: Cys 3: His4: Met 5: Arg 6: Gln 7: He 8: Phe 9: Asn 10: α-ΚΑ 11: Leu 12: Pro 13: Asp14: Gly 15: Lys 16: Sar 17: Ser 18: Thr 19: Trp 20: Val 21: Glu;b图中5毫摩/升的α-ΚΑ，200微摩/升的半乳糖(Galactose(Gal))，乙二醛Glyoxal(GO)，过氧化氢(Η-2Ο2)，丙酮酸钠 sodium pyruvate(PAS)，苯甲酰甲酸phenylglyoxal(PGO)，丙酮酸(methylglyoxal)和苯丙酮酸(phenylpyruvic acid)。
[0058]首先，相对于待测物α-ΚΑ，HNBD对氨基酸表现出极差的响应，这应该是由于氨基酸与α-ΚΑ在结构上有明显不同所致。当加入过量醛糖、酮糖、乙二醛、丙酮酸盐和苯甲酰甲醛时，HNBD依然保持了对待测物α-ΚΑ优秀的选择性。虽然200 μΜ的丙酮醛引起了HNBD的微小响应，但这并不会带来检测的干扰，毕竟丙酮醛在生物体内可能存在的浓度一般小于2 μΜ。因此，优秀的选择性使得HNBD完全适合在生物样本中的应用。同时，通过pH滴定实验发现，在PH值为5.4?7.4的区间范围，荧光的强度未出现在显著变化，这表明该探针在生物环境即pH为7.4时是完全适用的。此外，温度实验也证实了本探针非常适用于生物样品。
【主权项】
1.一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法，其特征在于，步骤为:将NBD-Cl溶解于氯仿中，溶解浓度0.002?0.012 g/mL，然后加入体积浓度为0.2?1.2%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得棕色产物alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的NBD-Cl溶解于氯仿中溶解浓度优选0.006g/mL;水合肼-甲醇溶液体积浓度优选0.6%。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针，检测效果指标如下: 检测灵敏度:检测限0.9pmoL/L;荧光增强倍数为20?60倍； 吸收波长改变:检测时吸收向红光移动100 nm； 颜色变化:在日光灯下颜色由淡绿色变为红色;紫外灯下的颜色由无色变为绿色； 双重定量校正:兼具荧光定量功能及吸收峰比率定量功能； 光学机理指标:兼具PET荧光开关功能及吸收红移功能。4.alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的应用，其特征在于:适用于生物样本中alpha-酮戊二酸的定性、定量分析;其中生物样本包括血清、活细胞、肌肉组织，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:定量分析生物样本中alpha-酮戊二酸时，适用于检测血清中alpha-酮戊二酸含量;定性分析生物样本中alpha-酮戊二酸时，适用于血清样品中alpha-酮戊二酸的肉眼监测、活细胞内alpha-酮戊二酸的监测和肌肉组织内alpha-酮戊二酸的监测。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测血清中alpha-酮戊二酸含量的方法，步骤包括: I)配制溶液 探针HNBD储备液配制:准确称取alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针溶于无水乙腈，配制浓度为2 X 10—4M的探针HNK)储备液； 待测目标物alpha-酮戊二酸(α-ΚΑ)储备液配制:准确称取待测目标物alpha-酮戊二酸溶于无水乙腈，配制浓度为I X 10—3 M的alpha-酮戊二酸储备液； 血清储备液配制:将血清和无水乙腈按体积比5:1混合，转速5000 rpm离心20min，取上清液过0.2 pm膜处理得血清储备液； 2 )建立血清/alpha-酮戊二酸标准品的线性方程 取步骤I)配制的待测目标物alpha-酮戊二酸储备液稀释得到梯度浓度为2?900μΜ的alpha-酮戊二酸标准品溶液，然后分别取200 yL稀释后2?900μΜ alpha-酮戊二酸标准品溶液与10yL探针HNBD储备液和650 血清储备液混合后，加入50 pL度为10 mM、pH7.4的PBS缓冲液，振摇混合均匀，于37 °C下放置60min，然后经荧光分光光度计和紫外光谱仪检测，建立血清/α-ΚΑ浓度与荧光信号强度的线性方程或血清/α-ΚΑ浓度与紫外吸收信号强度的线性方程； 3)荧光或紫外方法检测血清待测样品中alpha-酮戊二酸含量 a)荧光检测待测样品:将1001IL待测样品注入石英比色皿后，于荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入血清/α-ΚΑ浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得alpha-酮戊二酸含量； b)紫外检测待测样品:将1001IL待测样品注入石英比色皿后，置入紫外分光光度计，收集最大吸收波长位置的强度，求出反应前后最大吸收峰强度比率并代入血清/α-ΚΑ浓度与紫外吸收信号强度，计算得alpha-酮戊二酸含量。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于::最优检测范围为荧光3?QOOnmol/L，紫外80?200ymol/L。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，血清样品中alpha-酮戊二酸的肉眼监测，方法为:将待测血清样品和无水乙腈按体积比5:1混合，转速5000 rpm离心20min，取上清液过0.2 pm膜处理，取所得上清液200μ?并依次加入101IL探针HNBD储备液和200μ? alpha-酮戊二酸储备液，然后用pH 7.4的PBS缓冲液定容至lOOOyL，所得溶液在37 °C保存50?70min，置于荧光显微镜下观测成像，根据发光情况判断血清样品中是否含有alpha-酮戊二酸； 颜色判断方法:若紫外灯下显绿色或日光灯下淡红色，则含有alpha-酮戊二酸。9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，活细胞内alpha-酮戊二酸的监测，方法为:将待测活细胞置入培养基中培育18?26h，待测活细胞在培养基中达到2 X 17?9 X 17个/mL时，加入3?5倍体积20 μΜ探针HNBD-乙腈溶液于37 °C共培育10?12h，以I3BS缓冲液洗涤三次，置于荧光显微镜下观测成像，根据发光情况判断待测活细胞中是否含有alpha-酮戊二酸； 判断方法:紫外灯下显绿色，则含有alpha-酮戊二酸； 所述的活细胞优选酵母菌细胞;所述的培养基优选蛋白胨葡萄糖琼脂。10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，肌肉组织内alpha-酮戊二酸的监测，方法为:将待测肌肉组织切成厚I?1.5mm的片层，与3?5倍体积20 μΜ的探针HNBD-乙腈溶液，在37 °C下于培养基中共培育I?2 h，然后用PBS缓冲液洗涤，置于荧光显微镜下观测成像，根据发光情况判断待肌肉组织中是否含有alpha-酮戊二酸； 判断方法:紫外灯下显绿色，则含有alpha-酮戊二酸； 所述的培养基由1?七％脂提取物、2^%蛋白胨和2wt%葡萄糖的水溶液于121°C培养20min制得。
【专利摘要】本发明涉及一种alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用。制备方法步骤为：将NBD-Cl溶解于氯仿中，溶解浓度0.002~0.012？g/mL，？然后加入体积浓度为0.2%~1.2%的水合肼-甲醇溶液，混合均匀，室温下搅拌得棕色沉淀，过滤，滤饼经乙酸乙酯洗涤，烘干，得棕色产物alpha-酮戊二酸的荧光/紫外分子探针。适用于生物样本中alpha-酮戊二酸的定性、定量分析，检测灵敏、准确、快捷；其中生物样本主要包括血清、活细胞、肌肉组织等，可应用于分析化学、生命有机分析、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。具有响应性好、数据的准确性、重现性、精密度高等优点，设备便捷易操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。
【IPC分类】G01N21/33, G01N21/64, C07D271/12
【公开号】CN105503768
【申请号】CN201610050322
【发明人】陈 光, 付强, 王亦琳, 李秀, 刘玉霞, 王桦, 张书圣, 尤进茂
【申请人】曲阜师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月26日