一种含有pfb-1引物对的猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体设及一种猪粪便污染检测试剂盒及其制备与 应用。
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【背景技术】
[0003] 当今社会经济发展快速，水体环境经常被微生物污染，特别是饮用水受病原菌污 染后引发传染性疾病日益严重。大部分肠道传染病可通过水环境传染，但是污染源很难确 定，污染致病菌难W准确示踪，运些都是当前常规的检测指标和检测方法不能完全解决的 问题。因此，找到一个有效、快速、与污染源直接关联的新指示菌指标用来弥补当前检测的 不足是当务之急。在中国环保局颁布的地表水环境质量标准中，粪便中的大肠杆菌 (Escherichia coli)菌落数是一个重要的指标，运是因为粪便污染是水体污染的一个重要 因素之一。粪便中可能含有许多致病细菌，如大肠杆菌〇157、H7和沙口氏菌（Salmonella)， 原生动物隐抱子虫（CiTptosporidium protozoan)，肝炎病毒（Hepadnavividae )。粪大肠 杆菌(Fecal col iform )、大肠杆菌和肠球菌(Enterococcus)能够被全世界很多国家作为 水体污染的指示菌，是因为他们的检测相对简单，比较符合粪便污染检测指标中对示踪微 生物的要求，水体中运些微生物的含量是反映水质污染程度和水质是否安全的重要指标， 也是水体利用和污水治理的主要依据。大肠杆菌是最早作为粪便污染的指示微生物，随后 粪大肠菌群、总大肠杆菌（TotaVfecal coliforms)、肠球菌属、拟杆菌（Bacteroides)、产 气芙膜梭菌(Clostridium perfringens )等肠道微生物相继作为示踪菌，运些指示菌成 功示踪了多起粪便污染水质事故，为水污染的粪便来源追踪提供了强有力的证据。
[0004] 随着养猪产业的快速发展，猪粪尿造成的环境污染也日益严重，猪粪尿中含有大 量的氮、憐、钟，直接排放到水中会造成水体富营养化。目前，水质监测的生物指标为大肠杆 菌数和细菌总数，然而运些指标只能反映水体状况，无法实时监控水体污染，也无法定位水 体污染源。
[000引因此，能够准确检测猪粪便污染是当务之急。
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【发明内容】
[0007] 针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪粪便污染检测试剂 盒及其制备与应用。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明的第一方面，提供一种猪粪便污染检测引物对，包括正向引物和反向引物，所述 正向引物的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为:GGCGGGAGAGCAAGTCAGTG;所述反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID ^.2所示，具体为:〔61^467^640：0：46〔八八。
[0009] 本发明的第二方面，提供了前述猪粪便污染检测引物对在制备猪粪便检测试剂或 检测试剂盒中的用途。
[0010] 本发明的第Ξ方面，提供一种猪粪便污染检测试剂盒，所述试剂盒含有前述猪粪 便污染检测引物对。
[0011] 优选地，所述试剂盒还含有对照引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引 物，所述正向引物的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3所示，具体为:CTAACTACGTGCCAGCAGCC;所述 反向引物的如沈Q ID ^.4所示，具体为:60：口^60：4口'66了6口'0：。
[0012]本发明的试剂盒采用高灵敏性的PCR技术来进行猪粪便化ecalibacterium菌的检 巧。，采用所述猪粪便污染检测引物对进行PCR扩增，根据扩增情况可分析来判断猪粪便 化ecalibacterium菌感染情况。因此，引物对的设计是本发明试剂盒的关键。
[0013]基于本发明所述试剂盒采用的是PCR技术来进行检测的，所W试剂盒中还可W包 括其他一些PCR所需要的常规试剂，如:Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCb、dNTPs等常用PCR反应 试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此 具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可W根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装 配入试剂盒。
[0014] 所述PCR扩增反应液中，引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs均为常见组分， 其含量亦为常规。
[0015] PCR扩增反应液可自行配置，也可直接W市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加 入引物对获得。例如，所述试剂盒中还可W含有2X化wer化q PCR Master Mix。加入本发 明的猪粪便污染检测引物对即可获得PCR扩增反应液。
[0016] 所述试剂盒中还可含有阳性对照。阳性对照含有化ecalibacterium菌保守序列， 可为含有。日日。日116日。*日'川111菌保守序列的质粒。所述的阳性对照也可^为灭活的 化6。日1化日(：161'；[加1菌培养液。还可采用现有化6。日1化日(3161'；[加1菌检测试剂盒中的阳性对 照，也可单独市购或根据现有技术自行构建。
[0017] 所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有化ecal化acterium菌 的溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水(DEPC-出0)、生理盐水等。
[0018] 本发明的第四方面，提供一种猪粪便污染检测方法，其采用前述猪粪便污染检测 引物对或前述猪粪便污染检测试剂盒，包括如下步骤： (1)提取样品基因组DNA; (2 )加样:将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR 管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管； (3) PCR扩增:反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增； (4) PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。
[0019] 步骤（1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。优选地，可采用M0-BI0化werSoil? DM Isolation kit提取样品基因组DM。
[0020]优选地，步骤(2)中，各反应管中，PCR扩增反应液的体积为15 uL，含样品基因组 DNA luL，2XPower Taq PCR Master Mix,正向引物（10uM/L)0.5uL，反向引物（lOuM/L) 0.5uL，2X化wer Taq PCR Master Mix 7.加 L，无菌水补足至 15 uL。
[0021 ] 优选地，步骤（3)中，PCR扩增的程序为：预变性95°C/300s，1次循环；变性94°C/ 30s，延伸 67°C/30s，32 次循环。
[0022] 优选地，步骤(4)中，将扩增产物加 L用1%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
[0023] 本发明的第五方面，提供了前述试剂盒在制备猪粪便污染检测产品中的用途。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明的猪粪便污染检测引物对W及检测试剂盒对猪粪便污染检测特异性高达100%， 最低检测限(LOQs)为6.53拷贝数/反应，阳性率高达90%。采用所述引物对及试剂盒能够快 速判定水体是否被污染，并定位污染源。
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【附图说明】
[0026] 图1:六个物种的扩增产物加 L用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析所的结果。
[0027] 图2:六个物种定量PCR标准曲线结果。
[0028] 图3:50个阳性样品中有45个样品可W通过引物对PFB-1进行PCR扩增并可看到明 显条带，其阳性率为90%。
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【具体实施方式】
[0030] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的