具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0031] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0032] 实施例1试剂盒的制备 采集126份动物粪便样品（鸡，鸭，人，狗，猪，牛），经454焦憐酸测序得到146038条细菌 leSrDNA序列。通过将所得序列进行数据库比对，挑选出所有粪便样品中化ecalibacteri皿 菌leSrDNA基因序列，并做物种间的详细对比，设计出一对可特异鉴定猪粪便的DNA引物 PFB-1 (扩增长度：172bp)和一对化ecalibacterium菌leSrDNA通用引物FUP(扩增长度： 237bp)，引物的具体序列如下表1所示： 表1
采用现有技术合成上述引物对PFB-1和引物对即P-F，然后直接将上述引物对PFB-1装 配入试剂盒，或者上述引物对PFB-1和引物对即P-F-起装配入试剂盒。
[0033] 也就是说，本发明的试剂盒，含有引物对PFB-1。优选地，还可含有引物对即P-F。进 一步，所述试剂盒还可W含有2X化wer化q PCR Master Mix等试剂。
[0034] 实施例2试剂盒的使用 采用实施例1的试剂盒，对鸡，鸭，人，狗，猪，牛运六个物种的含化ecal化acterium菌粪 便样品进行检测。
[0035] 具体检测步骤如下： (1) 提取样品基因组DNA: 取鸡，鸭，人，狗，猪，牛运六个物种的的新鲜含化ecal化acterium菌粪便样品，分别编 号为1、2、3、4、5、6，每个物种设置3个重复；采用现有DNA提取试剂盒（例如：M0-BI0 PowerSoil? DNA Isolation kit)分别提取样品基因组DNA; (2) PCR扩增反应： 取步骤（1)中的各样品基因组DNA，采用分别W引物对PFB-1、引物对即P作为引物，进行 PCR扩增。
[0036] PCR扩增反应液如下表2或表3所示： 表 2_^^
然后进行PCR扩增反应，PCR扩增的程序如下： PFB-1:预变性95°C/300s，1次循环;变性94°C/30s，延伸67°C/30s，32次循环。
[0037] FUP-F:预变性 95°C/300s，1 次循环;变性 94°C/30s，延伸 60°C/30s，32 次循环。
[003引 （3)特异性验证： 取步骤(2)中所得六个物种的扩增产物5uL用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图1 所示，引物对PFB-1能够扩增猪粪便中化ecalibacterium菌并产生相应条带，但是引物对 PFB-1不能够扩增鸡，鸭，人，狗和牛粪便中的化ecal化acterium菌因而不能够产生相应的 条带说明，引物对能够特异性扩增PFB-1猪粪便中F'aecalibacterium菌，具有100%的特异 性。而通用引物对即P-F对六个物种粪便中化ecalibacterium菌都能扩增并产生相应的条 带，因此可采用通用引物对即P-F作为对照，分别采用引物对PFB-1和通用引物对即P-F进行 PCR扩增，均能产生条带的样品，才判定为猪粪便化eca 1 ibacterium菌阳性，从而提高检测 的准备率。
[0039] (4)灵敏度验证： 如图2所示的定量PCR标准曲线，经计算，引物对PFB-1的最低检测限化OQs )为6.53拷贝 数/反应，充分表明，引物对PFB-1具有很高的灵敏度。
[0040] 巧）阳性率验证： 选取50个猪粪便Fae ca 1 i bac t er ium菌阳性，按照步骤（1)和(2 )中的方法提取样品基因 组DNA并进行PCR扩增，扩增产物加 L用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，部分结果如图3所示，50 个阳性样品中有45个样品可W通过引物对PFB-1进行PCR扩增并可看到明显条带，其阳性率 为90%，说明引物对PFB-1具有较好的稳定性。
[0041] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此 技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举 凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所掲示的精神与技术思想下所完成的 一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种猪粪便污染检测引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 根据权利要求1所述的猪粪便污染检测引物对在制备猪粪便检测试剂或检测试剂盒 中的用途。3. -种猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1所述猪粪便 污染检测引物对。4. 根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有对照 引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述反向引物的如SEQ ID NO.4所示。5. 根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有2 X Power Taq PCR Master Mix〇6. 根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性 对照，阳性对照含有Faecalibacterium菌保守序列。7. 根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阴 性对照，阴性对照可为各种不含有Faecalibacterium菌的溶液。8. -种猪粪便污染检测方法，其采用如权利要求1所述猪粪便污染检测引物对或如权 利要求3~7任一权利要求所述的猪粪便污染检测试剂盒，包括如下步骤： 提取样品基因组DNA; 加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管 中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管； PCR扩增:反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增； PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。9. 如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，各反应管中，PCR扩增反应液 的体积为15 uL，含样品基因组DNA luL，2XPower Taq PCR Master Mix，正向引物（10uM/ L)0.5uL，反向引物（10uM/L)0.5uL，2XPower Taq PCR Master Mix 7.5uL，无菌水补足至 15 uL〇10. 如权利要求1~7任一权利要求所述试剂盒在制备猪粪便污染检测产品中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。本发明所述试剂盒含有前述猪粪便污染检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。所述试剂盒对猪粪便污染检测特异性高达100%，最低检测限（LOQs）为6.53拷贝数/反应，阳性率高达90%。采用所述引物对及试剂盒能够快速判定水体是否被污染，并定位污染源。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12R1/01, C12Q1/68
【公开号】CN105506134
【申请号】CN201610036898
【发明人】段传人, 崔亚敏, 张坤, 孙达, 张宝云
【申请人】重庆大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月20日