一种丹酚酸a的提取分离纯化方法及丹酚酸a盐的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药物有效成分丹酚酸A的提取分离纯化方法及其盐的制备方法，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002]丹参是最常用的药材之一，用于治疗心绞痛、高血压、冠心病和中风等心脑血管疾病。白花丹参(Salvia milt1rrhiza Bunge var alba)是唇形科植物丹参的变型，主要分布在山东省境内，在当地常作丹参使用。研究表明，白花丹参不但与丹参的化学成分基本相同，其中丹酚酸类成分均以丹酚酸B为主，丹酚酸A的含量都很少。
[0003]杜冠华等人对丹酚酸A的活性进行了大量的研究，发现丹酚酸A对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用，参见杜冠华，裘月，张均田.丹酚酸A对大鼠心肌缺血再灌注性损伤的保护作用[J].药学学报，1995,10:731-735。对小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤有保护作用，参见Du Guanhua,Zhang Juntian.Protective effect of salvianolic acidA against impairment of memory induced by cerebral ischemia—reperfus1n inmice.Chinese Medical Journal，1997，110，(I):65_68。还有研究发现，丹酷酸A对异丙肾上腺素诱导的心肌梗塞大鼠的心肌具有保护作用，参见Lian-hua FANG,Z1-ran NIUjTian-yi YUANjLi Li ,Yue-hua Wang,Guan-hua DU.Protective effect of salvianolic acidA against isoproterenol-1nduced myocardial infarct1n in mice[J].中国药理学与毒理学杂志，2015，S1: 31。丹酚酸A还具抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集和抗血栓形成等作用。参见Zhang XC,Chen JQjLi B，et al.Salvianolic Acid A Suppresses CCL-20Express1n in TNF—a—treated Macrophages and ApoE-deficient Mice.J Card1vascPharmacol,2014,64(4):318-325.Fan HY,Fu FH,Yang MY,et al.Antiplatelet andantithrombotic activities of salvianolic acid A.Thromb Res，2010，126( I): 17-e220
[0004]中国专利文件CN1384090A公开了从中药丹参中提取丹参总酚酸的方法及其制剂的制备方法，以及利用本发明方法得到的丹参总酚酸及其制剂在制备防治心脑血管疾病、防治老年痴呆症及治疗脑缺血引起的学习记忆力下降等药物中的应用;但是，该工艺增加醇沉使酚酸类损失30%。中国专利文件CN1513848A公开了一种用于肝损伤、肝纤维化等疾病的防治从中药丹参酚酸各组分的提取方法及其冻干粉针剂;该方法采用水温浸、离心、超滤、调酸、有机溶剂萃取再经反相柱层析制备丹酚酸A，使用反相硅胶纯化，对被纯化样品要求极高，反相硅胶的成本也很高，丹酚酸A在药材中含量低，甚至没有，因此丹酚酸A产率低，生产成本高。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明提供一种对丹酚酸A高含量药材中丹酚酸A的提取分离与纯化工艺及丹酚酸A盐的制备方法。
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]一种丹酚酸A的提纯分离纯化方法，包括以白花丹参或丹参为原料经溶剂提取、溶剂萃取、浓缩干燥、分离纯化、MCI柱分离、结晶与重结晶步骤，得丹酚酸A;
[0008]所述的溶剂提取步骤为:以70wt%-90wt%的乙醇溶液为提取溶剂进行提取，所用溶剂体积量与白花丹参或丹参原料的重量比为(8?12): l(v/w)，重复提取次数2-4次，超声加热至30°C_70°C，加热30-50分钟，除去药渣，合并滤液。
[0009]根据本发明，溶剂提取步骤中，所述乙醇溶液浓度优选75wt%;
[0010]所用溶剂体积量与白花丹参或丹参原料的重量比优选12:1;
[0011]所述反应温度优选30°C;
[0012]所述超声时间优选40分钟；
[0013]所述重复提取次数优选3次。
[0014]根据本发明，优选的，溶剂萃取步骤为:将溶剂提取步骤所得滤液，减压浓缩至无乙醇，加水稀释，加水量为稀释前浓缩液重量的2倍，再以有机溶剂萃取脱脂，弃去有机层，以2.5N盐酸调pH= I?2，再以有机溶剂第二次萃取，得含丹酚酸A的有机层；
[0015]所述萃取脱脂用的有机溶剂为石油醚、二氯甲烷或氯仿，优选为二氯甲烷；
[0016]所述第二次萃取用的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸丁酯，优选的为乙酸乙酯。
[0017]根据本发明，优选的，浓缩干燥步骤为:将含丹酚酸A的有机层，采用减压浓缩或者常压浓缩，干燥采用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥，得丹酚酸A粗品粉末；
[0018]进一步优选的，浓缩采用减压浓缩，干燥采用冷冻干燥。
[0019]根据本发明，优选的，分离与纯化步骤为:采用聚酰胺柱色谱分离纯化或镁盐络合分离纯化；
[0020]所述的聚酰胺柱色谱分离纯化步骤为:将浓缩干燥得到丹酚酸A粗品粉末，用水或者10wt-20wt %乙醇溶液溶解后，配成7g/L?20g/L的样品溶液，直接加到聚酰胺柱的顶端，使其缓慢流过聚酰胺柱，然后以水或者10wt-20wt%Z醇洗脱至流出液遇三氯化铁阴性反应;先用15wt %-25wt %乙醇溶液第一次洗脱，再以40wt %-50wt %乙醇溶液第二次洗脱，洗脱液减压浓缩至无乙醇，浓缩干燥，得纯化的丹酚酸A粉末；
[0021 ]所述的镁盐络合分离纯化步骤为:(I)分别取MgCl2和NaHCO3,溶于蒸馏水中，制备以Mg(HCO3)2计其浓度为Iwt?10被％混合溶液；(2)取浓缩干燥得到的丹酚酸A粗品粉末，加入步骤(I)所制得混合溶液中，溶解完全，用混合溶液等体积量的二氯甲烷萃取2次，弃去二氯甲烷层，所得水层以2.5N盐酸调pH=l?2后以等水层体积量的乙酸乙酯进行萃取3次，乙酸乙酯层萃取液减压浓缩，干燥，得纯化的丹酚酸A样品。
[0022]根据本发明，镁盐络合分离纯化步骤中，步骤(I)中所述MgCl2与NaHCO3的摩尔比优选为1:2，所述的混合溶液以Mg(HC03)2计浓度优选为3wt?5wt%。
[0023]根据本发明，聚酰胺柱色谱分离纯化步骤中，所述聚酰胺树脂柱径高比优选为1:4；
[0024]所述溶解丹酚酸A粗品粉末的溶剂优选为10wt%乙醇溶液；
[0025]所述丹酚酸A粗品溶液的质量浓度优选为10?12g/L;
[0026]所述聚酰胺树脂柱的上样量优选为每克聚酰胺树脂上样1.6g_1.7g丹酚酸A粗品粉末，吸附的丹酚酸A量为60mg-70mg ；
[0027]所述聚酰胺树脂柱的上样体积优选为每克聚酰胺树脂上样150ml;
[0028]所述第二次洗脱聚酰胺柱的乙醇溶液浓度优选为50wt%，洗脱体积优选为10个保留体积。
[0029]根据本发明，优选的，MCI柱分离步骤为:将分离与纯化步骤所得丹酚酸A样品，采用MCI柱色谱法分离，干法上样，以20%?100% (v/v)甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得纯度更高的丹酚酸A。
[0030]根据本发明，优选的，MCI柱分离步骤中，先采用20%?30% (v/v)甲醇洗脱MCI柱除杂质，再用40 %?50 % (v/v)甲醇洗脱MCI柱，收集洗脱液。
[0031]根据本发明，优选的，结晶与重结晶步骤为:将MCI柱分离所得丹酚酸A以二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行结晶和重结晶，过滤结晶;再以同样方法进行重结晶，过滤结晶，即得高纯度的丹酚酸A，纯度大于90 %。
[0032]根据本发明，优选的，结晶与重结晶步骤中，所述的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为1:9?9: l(v/v)，进一步优选为3:7?4:6(v/v)。
[0033]根据本发明，优选的，原料白花丹参或丹参可参考中国专利文件CN102793745A(申请号:201210334295.7)公开的方法进行预处理。
[0034]本发明的丹酚酸A提取纯化方法，采用溶剂提取、溶剂萃取、浓缩干燥、分离纯化、MCI柱分离、结晶与重结晶步骤，达到分离纯化丹酚酸A的目的。该方法最终提取物丹酚酸A的纯度高达90%以上，性能稳定，工艺简单，生产成本低。
[0035]根据本发明，一种丹酚酸A铵的制备方法，步骤如下:
[0036]上述制备的高纯度丹酚酸A粉末，加入50 %浓度的乙醇，滴入pH= 10浓氨溶液，将溶液PH调至6.5?7.4，在55°C条件下减压蒸干，即得丹酚酸A铵盐。此过