例6
[0088]一种丹酚酸A镁盐的制备方法，步骤如下:
[0089]取1mg实施例2所得的高纯度的丹酚酸A粉末，加入至Ij3ml浓度为0.064^MgCl2蒸馏水溶液中，室温下搅拌，然后滴加浓度为0.0951 ^NaHCO3或0.101 ^KHCO3蒸馏水溶液2ml，滴加完毕后，继续搅拌2?5分钟，然后冷冻干燥，即得含有氯化钠(或氯化钾)的丹酚酸A镁盐络合物粉末。1H NMR(600MHz,D20)57.44(d,J=15.0Hz,lH) ,6.91(s,lH) ,6.73-6.67(m,2H),6.62(dd ,J=18.9,8.1Hz,3H),6.52(d ,J = 8.0Hz,lH),6.45(d ,J = 7.3Hz,lH),6.41(d,J = 8.0Hz,lH),6.12(d ,J= 16.4Hz, 1H), 5.90(d ,J= 15.0Hz, 1H)，4.89(dd，J = 7.7，3.9Hz，1H)，2.91(d, J = Il.0Hz，lH)，2.82(dd，J = 14.2,8.1Hz，1H)。
[0090]对比例I
[0091]如实施例1所述，不同的是分别取5g相同的药材，以步骤(I)中分别为20wt%-95wt%不同浓度的乙醇为提取溶剂进行超声提取，提取温度、时间、次数同实施例1，合并提取液，以250ml容量瓶定容250ml。进样量为10μ1，采用高效液相色谱法(HPLC)测定丹酚酸A的含量，以丹酚酸A的峰面积表示其含量。
[0092]HPLC色谱条件:色谱柱:Agilent TC-C 18(4.6 X 250mm，5μπι);流速:I.00mL/min;检测波长:286nm;柱温:25°C ；流动相A:0.05%的磷酸水溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱条件:0?15min，90% ?80%A; 15?35min，80% ?75%A;35?45min，75% ?70%A;45?55min，70% ?10%A;55 ?70min，10%A。
[0093]不同浓度乙醇为提取溶剂的提取结果曲线如图6所示。
[0094]通过对比实施例1和对比例I可知，溶剂提取过程中乙醇溶液的浓度为70_80wt %效果比较好，其中75%的乙醇浓度提取效果最佳。
[0095]对比例2
[0096]如实施例1所述，不同的是步骤(4)中采用1wt %-95wt%F同浓度的乙醇进行洗脱，每一个不同浓度的乙醇洗脱4个保留体积，分别收集不同浓度的洗脱液，定容。进样量为10μ1，采用高效液相色谱法(HPLC)测定丹酚酸A的含量，以丹酚酸A的峰面积表示其含量。
[0097]HPLC色谱条件同对比例I，不同浓度乙醇的洗脱曲线如图7所示。
[0098]通过对比实施例1和对比例2可知，聚酰胺树脂柱分离纯化过程中，洗脱除杂用的乙醇溶液的浓度为20wt %效果最佳。
[0099]对比例3
[0100]如实施例1所述，不同的是步骤(4)中洗脱丹酚酸A用的乙醇溶液浓度，参照对比例2的实验结果，分别采用40^%、50的％的乙醇进行洗脱，收集流出液，每个保留体积收集I份。采用HPLC测定丹酚酸A的含量，进样量为10μ1，以丹酚酸A的峰面积表示其含量。
[0101]HPLC色谱条件同对比例I，40wt %乙醇洗脱的洗脱曲线如下图8，50wt %乙醇洗脱的洗脱曲线如下图9。
[0102]将40wt%乙醇洗脱下来的16个保留体积合并，减压蒸去乙醇，冷冻干燥，以HPLC进行含量测定，采用丹酚酸A的标准曲线计算其洗脱物中丹酚酸A的含量。则40^%乙醇洗下来的丹酚酸A量为29.26mg，固形物质量158.2mg，纯度达18.5%，洗脱率为67.73%。
[0103]采用与40wt %乙醇洗脱相同的方法进行处理，50的％乙醇洗脱16个保留体积，乙醇洗下来的丹酚酸A量为41.08mg，固形物质量144.8mg，纯度达28.4%,洗脱率为95.1 %。
[0104]通过对比例2的实验结果以及比较40wt%乙醇和50wt%乙醇的洗脱结果可知，聚酰胺树脂柱分离纯化过程中，洗脱丹酚酸A用的乙醇溶液的浓度为40wt %-50wt %效果较好，其中50wt %洗脱效果最佳。
【主权项】
1.一种丹酚酸A的提纯分离纯化方法，包括以白花丹参或丹参为原料经溶剂提取、溶剂萃取、浓缩干燥、分离纯化、MCI柱分离、结晶与重结晶步骤，得丹酚酸A; 所述的溶剂提取步骤为:以70wt%-90wt%的乙醇溶液为提取溶剂进行提取，所用溶剂体积量与白花丹参或丹参原料的重量比为(8?12): l(v/w)，重复提取次数2-4次，超声加热至30°C_70°C，加热30-50分钟，除去药渣，合并滤液。2.根据权利要求1所述的丹酚酸A的提纯分离纯化方法，其特征在于，溶剂提取步骤中，所述乙醇溶液浓度为75wt% ; 所用溶剂体积量与白花丹参或丹参原料的重量比优选12:1; 所述反应温度优选30°C; 所述超声时间优选40分钟； 所述重复提取次数优选3次。3.根据权利要求1所述的丹酚酸A的提纯分离纯化方法，其特征在于，溶剂萃取步骤为: 将溶剂提取步骤所得滤液，减压浓缩至无乙醇，加水稀释，加水量为稀释前浓缩液重量的2倍，再以有机溶剂萃取脱脂，弃去有机层，以2.5N盐酸调pH= I?2，再以有机溶剂第二次萃取，得含丹酚酸A的有机层； 所述萃取脱脂用的有机溶剂为石油醚、二氯甲烷或氯仿，优选为二氯甲烷； 所述第二次萃取用的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸丁酯，优选的为乙酸乙酯。4.根据权利要求1所述的丹酚酸A的提纯分离纯化方法，其特征在于，浓缩干燥步骤为: 将含丹酚酸A的有机层，采用减压浓缩或者常压浓缩，干燥采用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥，得丹酚酸A粗品粉末； 优选的，浓缩采用减压浓缩，干燥采用冷冻干燥。5.根据权利要求1所述的丹酚酸A的提纯分离纯化方法，其特征在于，分离与纯化步骤为:采用聚酰胺柱色谱分离纯化或镁盐络合分离纯化。6.根据权利要求5所述的丹酚酸A的提纯分离纯化方法，其特征在于，所述的聚酰胺柱色谱分离纯化步骤为:将浓缩干燥得到丹酸酸A粗品粉末，用水或者10wt-20wt %乙醇溶液溶解后，配成7g/L?20g/L的样品溶液，直接加到聚酰胺柱的顶端，使其缓慢流过聚酰胺柱，然后以水或者10wt-20wt%乙醇洗脱至流出液遇三氯化铁阴性反应;先用15的％-25被％乙醇溶液第一次洗脱，再以40wt % -50wt %乙醇溶液第二次洗脱，洗脱液减压浓缩至无乙醇，浓缩干燥，得纯化的丹酚酸A粉末。7.根据权利要求5所述的丹酚酸A的提纯分离纯化方法，其特征在于，所述的镁盐络合分离纯化步骤为:(I)分别取MgCl2和NaHCO3,溶于蒸馏水中，制备以Mg(HCO3)2计其浓度为Iwt?10的％混合溶液；(2)取浓缩干燥得到的丹酚酸A粗品粉末，加入步骤(I)所制得混合溶液中，溶解完全，用混合溶液等体积量的二氯甲烷萃取2次，弃去二氯甲烷层，所得水层以2.5N盐酸调pH=l?2后以等水层体积量的乙酸乙酯进行萃取3次，乙酸乙酯层萃取液减压浓缩，干燥，得纯化的丹酚酸A样品。8.根据权利要求1所述的丹酚酸A的提纯分离纯化方法，其特征在于，MCI柱分离步骤为:将分离与纯化步骤所得丹酚酸A样品，采用MCI柱色谱法分离，干法上样，以20%?100%(v/V)甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得纯度更高的丹酚酸A。9.一种丹酚酸A铵的制备方法，步骤如下: 将权利要求1 -8任一项制备的高纯度丹酚酸A粉末，加入50 %浓度的乙醇，滴入PH= 1浓氨溶液，将溶液PH调至6.5?7.4，在55°C条件下减压蒸干，即得丹酚酸A铵盐。10.一种丹酚酸A镁盐的制备方法，步骤如下: 取MgC 12溶于蒸馈水，配制成浓度为0.1wt %?5wt %的溶液，加入权利要求1 -8任一项制备的高纯度丹酚酸A粉末，室温下搅拌，然后滴加0.1wt %?5wt ^NaHCO3或KHCO3的蒸馏水溶液，滴加完毕后，继续搅拌2?5分钟，然后冷冻干燥，即得含有氯化钠(或氯化钾)的丹酚酸A镁盐络合物粉末。
【专利摘要】本发明涉及一种丹酚酸A的提取分离纯化方法及丹酚酸A盐的制备方法，所述丹酚酸A的提取分离纯化方法包括以白花丹参或丹参为原料经溶剂提取、溶剂萃取、浓缩干燥、分离纯化、MCI柱分离、结晶与重结晶步骤，得丹酚酸A。本发明与大孔吸附树脂柱相比，采用聚酰胺柱色谱法可以更有效的纯化酚酸类成分，纯化效果更好；采用丹酚酸A镁盐络合法，可以省去大孔吸附树脂、或聚酰胺柱色谱的层析过程，纯化方法更简单和省时，成本更低。丹酚酸A镁盐的制备方法简单，更适合于大生产；丹酚酸A铵盐是一种新的丹酚酸A盐类化合物。
【IPC分类】C07C67/28, C07C69/732, C07C67/56, C07C67/48
【公开号】CN105523926
【申请号】CN201511019464
【发明人】孙隆儒, 张愉, 朱炳洁, 季梅
【申请人】山东大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月29日