转基因玉米ie034外源插入片段3’端旁侧序列及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体设及一种转基因玉米IE034外源插入片段3' 端旁侦膊列及定性PCR检测方法，W及用于检测该序列的PCR引物、探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 玉米作为我国Ξ大粮食作物之一，播种面积和总产量均居第二位，在我国粮食安 全中发挥着重要的作用。近年来，国内玉米种植面积保持在5亿亩W上，同时，每年还要进口 300万-500万吨的转基因玉米弥补消费缺口。而随着饲用玉米需求的刚性增长和近年来玉 米深加工业的快速发展，国内玉米消费还将持续增长。但是病虫害、杂草、干旱、盐碱等生物 或非生物胁迫严重影响了玉米生产。培育具有抗虫、抗除草剂、抗病等性状的转基因玉米品 种并应用到实际生产中，能够减少玉米产量损失，减少农药化肥使用量。其中化蛋白的发现 掲开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。化杀虫蛋白基因来源于苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis即化杆菌），是天然存在于±壤中的格兰氏阳性菌，在其芽抱形成过程中产 生许多W结晶方式存在的蛋白质，运些蛋白质具有杀虫活性，通常也被称为化杀虫蛋白。Bt 杀虫蛋白按氨基酸序列的同源性可分为45大类313种，Crylle抗虫基因属于BT杀虫蛋白家 族，是中国农业科学院植物保护研究所首次分离克隆出来的一种新的化y基因，随后中国农 业科学院作物科学研究所将Crylle基因通过农杆菌介导法转入到了中国玉米优良自交系 综31基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米事件IE034,现已在进行环境释放阶段的安全评 价，对于未来国内日益高涨的玉米需求，该抗虫玉米有可能进入商业化种植并推广。
[0003] 转基因玉米IE034已申请"农业转基因生物安全评价证书"，因而其分子特征，包括 插入序列、插入位点及其相应的检测方法都需要非常清晰，其中中国专利201210065919.X 提供了转基因玉米事件IE034插入位点的外源5'端旁侧DNA序列，该序列全长3^bp。但目前 尚不清楚转基因玉米事件IE034插入位点的外源3'端旁侧DNA序列，关键原因是3'端旁侧序 列结构更为复杂，受体基因组序列和载体序列间或出现，需要更精准的实验进行鉴定。因此 3'端旁侧DNA序列及鉴定方法是转基因玉米IE034安全管理不可或缺的部分。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供转基因玉米事件IE034插入位点的外源插入片段的3'端旁侧 DNA序列及其应用，W及用于检测该序列的PCR引物、探针和试剂盒。
[0005] 为达到W上目的，本发明提供了转基因玉米IE034外源插入片段3'端旁侧DNA序 列，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者为SEQ ID NO. 1所示序列的特异性片段。
[0006] 本发明还提供了所述DNA序列在检测转基因玉米中的应用。
[0007] 本发明还提供了用于检测权利要求1所述的DNA的特异性PCR检测引物及探针，所 述引物的核巧酸序列为：
[000引 上游引物：5 ' -CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '，
[0009]下游引物：5 ' -TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3 ' ；
[0010] 探针为：5 ' -F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3 '。
[0011] 可选的，在所述探针中，F为FAM、胎义、了61、如6、￥1。^116、〔73或切5;9为了日111拘、 Rox、Dabcy、Miq1或 Miq2。
[0012] 本发明还提供了一种转基因玉米IE034的检测试剂盒，所述试剂盒含有特异性PCR 检测引物及探针，所述引物的核巧酸序列为：
[0013] 上游引物：5 '-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '，
[0014] 下游引物：5'-了4了661'(：1'1'(：176(：1'1^6了6(：1'1'1'1'-3'；
[0015] 探针为：5 ' -F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3 '。
[0016] 可选的，在所述探针中，F为FAM、胎义、了61、如6、￥1。^116、〔73或切5;9为了日111拘、 Rox、Dabcy、Miq1或 Miq2。
[0017] 本发明还提供了一种转基因玉米事件IE034的检测方法，所述方法包括：W样品总 DNA为模板利用本发明所提供的引物及探针进行实时巧光PCR扩增反应，检测扩增反应产物 中是否具有SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0018] 可选的，所述实时巧光PCR扩增的反应程序为:95°C10min;95°C15sec，60°C60sec 40个循环。
[0019]可选的，实时巧光PCR扩增的反应体系为： 2-GoldStar TaqMan Mixture 1 ΟμL 上游引物UOuM) 0.4μ1
[0020]下游引物（lOuM) 0 4μΙ 探针 OOuM) 0.4μ1 DNA模扳 2μΙ
[0021 ]加入灭菌蒸馈水至总体系为20μ1。
[0022] 本发明还提供了上述引物及探针在检测转基因玉米中的应用。
[0023] 本发明还提供了上述试剂盒在检测转基因玉米中的应用。
[0024] 本发明通过ΤΑ化-PCR扩增得到了抗虫转基因玉米事件ΙΕ034的3'旁侧序列，并根 据该序列设计获得特异性引物和探针，用于检测转基因玉米ΙΕ034。利用该方法，在实时巧 光PCR结束后即能判断所检测样品中是否含有转基因玉米ΙΕ034。本发明所提供的旁侧序列 和引物适用于对转基因玉米ΙΕ034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品（包括植株、组织、种 子及其制品）的检测。
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1中Ξ轮反应的PCR产物电泳图：
[00%]其中，图1Α为第一轮PCR扩增产物，图1Β为第二轮PCR扩增产物，图1C为第Ξ轮PCR 扩增产物；
[0027] 图2为转基因玉米ΙΕ034实时巧光PCR检测结果；
[0028] 图3为灵敏度检测扩增曲线。
【具体实施方式】
[0029] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecy lar cloning:a laboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0030] 实施例1
[0031] 本实施例用于说明转基因玉米IE034的外源插入片段3'端侧翼序列的获得。
[0032] 1.提取玉米种子基因组DNA。
[0033] 1.1样品处理：
[0034] 取适量玉米种子（由中国农业科学院作物所王国英研究员提供转基因玉米 "IE034" W及对照玉米"综3Γ )在液氮速冻下经莱驰MM400冷冻研磨仪磨成粉末状
[0035] 1.2玉米种子DNA提取：
[0036] 采用天根DP305-02植物基因组DNA提取试剂盒提取玉米种子基因组DNA，操作按产 品说明书进行。
[0037] 1.3 DNA检测：
[0038] 取扣1提取的DNA溶液，W1 %的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提 取DNA的质量。最终采用ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定所提取的DNA的浓度和纯度。
[0039] 2.通过TAIL-PCR方法获得转基因玉米外源基因整合位点3 '端侧翼序列。
[0040] 2.1引物设计：
[0041 ]根据中国农业科学院作物所王国英研究员提供目的基因表达载体p3301UbiIe及 元件的结构，采用TAlX-PCR(the;rmal asymmetric interlaced PCR)技术，获得转基因玉米 外源基因整合位点3'端侧翼序列并设计如下表1所示的引物序列：
[0042] 表1每轮TAIkPCR扩增的引物序列
[0043]
[0044] 2.2 TAIkPCRPCR扩增：
[0045] 每轮TAIkPCR包含Ξ轮PCR扩增，具体如下：
[0046] 第一轮PCR扩增，W转基因玉米种子DNA为模板，用特异性引物SP F1-1和LAD1-1及 LAD1-2分别进行扩增；
[0047] 第二轮PCR扩增，将上述PCR产物稀释40倍，取化1为模板，分别用SPF2-1+AC和 SPF2-2+AC进行扩增；
[004引第Ξ轮PCR，将上述PCR产物稀释10倍，取化1为模板，用SP F3+AC进行扩增。