扩增程 序如下表2所示：
[0049] 表2每轮TAIkPCR扩增程序
[(K)加 ]
[0051] 2.3电泳检测：
[0052] 将2.2中PCR产物取化1进行电泳，电泳结果如图1A-C所示。
[0053] 图1A为第一轮PCR扩增产物电泳Jane 1-2为SP F1-1+LAD1-1扩增产物，lane 3-4 为SP Fl-l+LADl-2，lane 1-4均W转基因玉米DM为模板。
[0054] 图1B为第二轮PCR扩增产物电泳，lane 1-3为SPF2-1+AC扩增产物，lane 4-6为 SPF2-化AC扩增产物.其中lanel、4均W1A中的lane 2为模板，lane 2、5均W图1A中的lane 3为模板Jane 3、6均W图1A中的lane 4为模板。
[0055] 图1C为第Ξ轮PCR扩增产物电泳，lanel-6均为SPF3+AC扩增产物，lanel W图1B中 的lanel为模板，lane2W图1B中的lane2为模板，lane3W图1B中的lane3为模板，lane4W图 1B中的lane4为模板，lane5 W图1B中的lane5为模板，lane6 W图1B中的lane6为模板。
[0化6] 2.4序列测序和分析
[0057]将图1C中（第3轮PCR扩增产物)的lanel-6号亮带0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，采 用TAKARA公司的PCR产物回收试剂盒回收扩增片段，连接到PMD18载体(Takara)，转化大肠 杆菌，将得到的阳性克隆送到Invitrogen公司进行测序。采用DNA S化;r(ver 5.01)和BioXM (ver 2.6)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库（http ://WWW.ncbi .nlm.nib.gov/)中检索相似的玉米基因组序列。2.5结果分析 [005引提取转基因玉米IE034种子基因组DNA，利用特异性引物和随机引物进行TA比-PCR 扩增，获得了外源插入片段在玉米基因组整合位点的右边界28化P长的序列，包括第1-40共 40bp的玉米基因组序列和41-281共24化P的载体序列。如SEQ ID NO. 1所示。其中，玉米基因 组序列位于玉米5号染色体(GenBank登录号:AC203153.4)的86287-86326。
[0化9]实施例2
[0060] 实施例2用于说明针对转基因玉米IE034实时巧光PCR检测方法的建立。
[0061] 1.引物设计
[0062] 1.1通过分析外源插入片段在玉米基因组整合位点的右边界28化P长的序列，根据 其中包含的玉米基因组序列W及载体序列，设计如下引物和探针，引物和探针均在 invitrogen公司合成。
[0063] 上游引物：5 ' -CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '
[0064] 下游引物：5 ' -TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3 '
[00化]巧光探针为：
[0066] 5'-FAM-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-3'TAMRA
[0067] 预计扩增产物为14化P。
[0068] 2.实时巧光PCR反应体系
[0069] 2.1 反应体系：用GoldStar TaqMan Mixture(With R0X)(CWbio.Co 丄 tcUCat# CW0953)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为:95°C10min，（95°C15sec，60°C 60sec) X40个循环，报告通道为FAM，泽灭通道为TAMRADRealTime反应体系为： 2xGol(iStar Taq-Man Mix山re lOul 上游引物（lOuM) 0.4μ1
[0070] 下游引物（lOuM) 0.4μ1 探针（lOuM) 0.4μ1 技ΝΑ模狼 2μ1
[0071] 加入灭菌蒸馈水至20μ1。
[0072] 3实时巧光PCR检测方法特异性检测
[0073] W转基因玉米IE034(GM0+)、非转基因玉米综3112(GM0-)、转基因番茄(华番1号）、 转基因水稻化63、转基因棉花(转化抗虫基因）及转基因玉米齡11810、1〇1188017、证603、油菜 RT73、T45的总DNA为模板，进行实时巧光PCR反应，检测引物探针的特异性。
[0074] 4.实时巧光PCR检测方法灵敏度检测
[0075] 取转基因玉米IE034DNA进行10倍梯度稀释，做5个稀释度(如表3所示），稀释后样 品各取化1作模板。
[0076] 表3灵敏度RealTime PCR检测试验设计
[0077]
[0078] 5、结果分析
[0079] 5.1.特异性检测
[0080] 结果如图2所示。检测转基因玉米IE034的引物探针只在品系IE034有信号，在其它 材料中均无信号。
[0081 ] 图2转基因玉米IE034实时巧光PCR检测结果(基线W下为阴性对照:Bt63、KF6号、 华番 1 号、Mon810、Mon88017、nk603、油菜 RT73、T45)
[0082] 5.2.灵敏度检测
[0083 ]图3中灵敏度检测扩增曲线对应的ct值如下表4所示：
[0084] 表 4
[0085] _
[0086] 结果显示，在Ct值35 W内，设计的引物及探针可W检测DNA浓度最低限为0.33ng/y 1的转基因玉米IE034样品。
[0087] 6.结论
[0088] 本发明根据转基因玉米IE034右边界侧翼序列设计引物探针，用于检测转基因玉 米IE034。利用该方法，在实时巧光PCR结束后即能判断所检测转基因玉米样品是否为转基 因玉米IE034。
[0089] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 转基因玉米IE034外源插入片段3'端旁侧DM序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所 /J、- ο2. 权利要求1所述的DM在检测转基因玉米中的应用。3. 用于检测权利要求1所述的DNA序列的特异性PCR检测引物及探针，所述引物的核巧 酸序列为： 上游引物：5 ' -CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '， 下游引物：5 ' -TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3 ' ； 探针为：5 ' -F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3 '。4. 根据权利要求3所述的引物及探针，其中，F为FAM、皿 CY5;Q为TAMRA、R0X、DABCY、B册1或B册2。5. -种转基因玉米IE034的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求3或4所 述引物及探针。6. -种转基因玉米IE034的检测方法，其特征在于，所述方法包括：W样品总DNA为模板 利用权利要求3或4所述的引物及探针进行实时巧光PCR扩增反应，检测扩增反应产物中是 否具有SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述实时巧光PCR扩增的反应程序为： 95°C10min;95°C15sec，60°C60sec 40个循环。8. 根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，实时巧光PCR扩增的反应体系为： 2. GoldStar TaqMan Mixture ΙΟμΙ 上游引物（lOuM) 化斗μ1 下游引物（lOuM) 化斗μ1 探针（lOuM) {).4μ1 DNA模板 2μ1 加入灭菌蒸馈水至总体系为2〇μ1。9. 权利要求3或4所述的引物及探针在检测转基因玉米中的应用。10. 权利要求5所述的试剂盒在检测转基因玉米中的应用。
【专利摘要】本发明提供转基因玉米事件IE034插入位点的外源插入片段的3ˊ端旁侧序列及其应用。本发明还提供了用于检测该旁侧序列的引物、探针和试剂盒。本发明所提供的旁侧序列和引物适用于快速检测样品是否含有转基因玉米品系IE034，为转基因安全提供保障。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/29, C12N15/11
【公开号】CN105543238
【申请号】CN201610009212
【发明人】杜智欣, 付伟, 魏霜, 乾义柯, 王晨光, 朱鹏宇, 王国英, 朱水芳
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月7日