用于亲和色谱法和用于延长治疗剂的半衰期的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于亲和色谱法的化合物，更具体地设及用于亲和纯化血清白蛋白 (尤其是人血清白蛋白化SA))的化合物。该化合物还用于延长治疗剂(尤其是治疗性肤试剂 和小分子)的半衰期，如通过缀合至该治疗性肤或小分子(该治疗性肤或小分子在给药后结 合至HAS)，从而提供治疗剂的延长释放。
【背景技术】
[0002] 结合至人血清白蛋白的小分子已描述用于纯化生物分子（如血清白蛋白，包括人 血清白蛋白（HSA)，抗体和融合蛋白）（参见S. Subramanian，Dye-Ligand Affinity Chromatography : The Interaction of Cibacron Blue F3GA饭胖ith Proteins and E；nz;ymes,CRC Critical Reviews in Biochemist;ry(1984)voll6(2),pp. 169-205;美国专 利4，722，896;美国专利5，849，874;和PCT公开WO 2012/020080A2)。类似地，结合至人血清 白蛋白的小分子已描述用于延长通过注射给药的治疗剂的半衰期，尤其是治疗性肤试剂 (参见例女日L.Pollaro and C.Heinis , Strategoes to Prolong the Plasma Residence Time of Peptide Drugs,Med.Qiem.Commun.(2010)1,319-324)。
[0003] 需要另外的改善的化合物，所述化合物可用于从存在于细胞裂解液(lysate)或其 它液体混合物和溶液中的其它生物分子和化合物纯化、分离和/或捕捉运些生物分子。同 样，需要可用于安全和有效增加现有治疗性分子(尤其是治疗性肤、多肤和小分子）的半衰 期的另外的化合物，运些治疗性分子当给药于受试者后进入受试者的循环系统。
【发明内容】
[0004] 本发明的实施方案的特征为新的化合物，其用作直接纯化多种生物分子的亲和试 剂，所述生物分子如血浆蛋白质，包括血清白蛋白，尤其是人血清白蛋白和HSA-融合蛋白。 其它可纯化的生物分子包括免疫球蛋白、纤维蛋白原、α1-酸糖蛋白等;酶，包括淀粉酶、纤 维素酶、小牛肠碱性憐酸酶(CIAP)、乳酸脱氨酶化DH)等;和人工蛋白质或蛋白质结构域，包 括亲和标记的蛋白或结构域（如具有6His、FLAG、GST等标记）、Fc-融合蛋白、域抗体等。此 夕h当缀合至治疗剂特别是肤治疗剂时，运些化合物可用于延长该治疗剂在给药后在血液 中的半衰期。本发明的实施方案提供了新的化学类型，其对HAS(包括其片段和变体)具有高 亲和力和特异性，如当偶联至琼脂糖或另一底物时。而且，对于纯化HAS和HSA-融合蛋白，该 亲和树脂技术比可商购的配体具有显著更高的选择性。更高的选择性通过本发明的化合物 与白蛋白上的结合位点的特异性相互作用而实现。
[000引本发明的实施方案为式I或式II的化合物
[0006]
[0007]或其盐，
[000引其中r1为H、-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-CN、-N02、取代或未取代的C广C6烷基、取代或未 取代的C1-C6締基、取代或未取代的环烷基、芳基或杂芳基；
[0009] 护为-[(C出)2E]n(C出)2NR'护且η为0至30的任意整数，
[0010] 其中R'和r各自独立地为Η、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C1-C6締 基、或取代或未取代的环烷基；
[0011] 芳基为任何取代或未取代的、完全或部分芳香的控取代基或杂芳基取代基；
[001引 Y哺Y3独立地为C、0、N、NR2或S，其中R2为H、取代或未取代的&-C6烷基、取代或未取 代的C1-C6締基、取代或未取代的环烷基、芳基或杂芳基;Y2为C或N;
[001引 A和D独立地为
脉、硫代酷胺，或A和/或D不存在，其中 R'为H、取代或未取代的Ci-Cs烷基、取代或未取代的Ci-Cs締基、取代或未取代的环烷基、芳 基或杂芳基；
[0014] B为取代或未取代的。-C9-环烷基、取代或未取代的包含N、0或S的。-C9-杂环烧 基、取代或未取代的包含N、0、S的杂芳基，或B不存在；
[0015] C为W下任意一种：
[0016]
芳基、杂芳基、脉、硫代酷胺，或C不存在， Y
[0017] 其中R'和/或R"各自独立地为H、取代或未取代的Ci-Cs烷基、取代或未取代的Ci-Ce 締基、取代或未取代的环烷基、芳基或杂芳基；
[001引 E为邸2、0、畑或S，或E不存在；
[0019] Z为取代或未取代的芳基、取代或未取代的包含N、0或S的杂烷基，或取代或未取代 的包含N、0、S的杂芳基，或Z不存在。
[0020] 在另一方面，本发明提供了式HI或式IV的化合物
[0021]
[0022] 或其盐，其中：
[002引各Zi、Z2、Z3和Z4独立地选自N和CRi且Zi、Z2、Z3和Z冲的不超过两个为N，且各r1独立 地选自H、-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-CN、-N02、取代或未取代的C广C6烷基、取代或未取代的C广C6 烷氧基、取代或未取代的C1-C6締基、取代或未取代的环烷基、芳基或杂芳基；
[0024] 护为-[(C此)2E]n(C出)2NR'护且η为0至30的任意整数，其中R'和护各自独立地为H、 取代或未取代的C广C6烷基、取代或未取代的C广C6締基、或取代或未取代的环烷基；
[0025] 芳基为任何取代或未取代的、完全或部分芳香的控取代基或杂芳基取代基；
[0026] Υ哺Υ3独立地为C、CR2、0、N、NR2或S，其中R2为H、取代或未取代的C广C6烷基、取代或 未取代的C1-C6締基、取代或未取代的环烷基、芳基或杂芳基；
[0027] γ2为C;
[002引 A和D独立地为
脉、硫代酷胺，或A和/或D不存在； 、
[0029] B为取代或未取代的C4-C9-环烷基、取代或未取代的包含N、0或S的C4-C9-杂环烧 基、取代或未取代的包含N、0、S的杂芳基，或B不存在；
[0030] C为W下任意一种：
芳基、杂芳基、脉、硫代酷胺；
[0031 ] E为C出、0、畑或S，或E不存在;且
[0032] Z为取代或未取代的芳基、取代或未取代的包含N、0或S的杂烷基，或取代或未取代 的包含N、0、S的杂芳基，或Z不存在。
[0033] 如本文所公开，式I、式II、式ΙΠ 和式IV的化合物可结合至固相W制备亲和色谱的 固相，其用于从包含蛋白质和一种或多种杂质的水溶液分离感兴趣的蛋白质。例如，该固相 为琼脂糖。感兴趣的蛋白质可包括，例如，人血清白蛋白。该水溶液可为:源自细胞裂解液， 源自细胞收集物/肉汤（cell harvest/broth)，分离自体液（例如血液），或源自其它混合 物。例如，如本文所公开的亲和琼脂糖材料可用于从细胞裂解液和其它混合物纯化、分离或 捕捉多种生物分子。可从液体/水溶液混合物中的其它生物分子和杂质纯化、分离或捕捉的 生物分子为运样的生物分子，如血浆蛋白质，包括血清白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、曰 1-酸糖蛋白等;酶，包括淀粉酶、纤维素酶、小牛肠碱性憐酸酶(CIAP)、乳酸脱氨酶化DH)等； 和人工蛋白质或蛋白质结构域，包括亲和标记的蛋白或结构域(如具有6化3、尸1^\6、651'等标 记）、HSA-融合蛋白、Fc-融合蛋白、域抗体等。
[0034] 如本文所述的化合物也可用于延长治疗剂(尤其是肤、多肤和小分子治疗剂）的半 衰期。通常，肤在静脉内给药后在几分钟内从血流清除。肾似乎完全将小于化Da的分子滤 除，而较大的肤(大于~50-70W)a)似乎被有效保留和循环。然而，已知一些肤的肾清除率可 通过结合至可接触的(accessible)膜蛋白或血清蛋白而减少。循环中分子的寿命通常表示 为血浆半衰期，定义为通过系统（肾等）的消除而使循环中分子浓度减半所耗费的时间。因 为从血液消除静脉内给药的分子总是接近两相过程(第一相为由于分布至外周组织而快速 下降），第二相(通过肾等的消除而减少)为与术语"血浆半衰期"相关的减少部分，也通常称 为"消除半衰期"。
[0035] 本发明的实施方案因此提供了如本文所述的式I或式II的化合物，其缀合至治疗 剂(特别是肤或多肤治疗剂），W用于延长治疗剂在血流中的消除半衰期或血浆半衰期。
[0036] 附图简述
[0037] 参考W下发明详述，并参考附图，本发明上述特征将更容易理解，其中：
[0038] 图1显示活化的琼脂糖和本文所述化合物之间反应制备亲和-缀合的琼脂糖珠子 的示意图。
[0039] 图2显示微型琼脂糖凝胶，其中与如本文所述的式I的化合物缀合的亲和琼脂糖珠 子用于从加入HAS的细胞裂解液制备/纯化HSA。
[0040] 图3显示缀合至式I的化合物的亲和琼脂糖材料对HSA-融合的肤的特异性，与 Mimetic Blue租相比。
[0041] 图4a显示不同缓冲溶液从如本文所述的亲和琼脂糖材料洗脱HAS的有效性的比 较。
[0042] 图4b显示图4a结果的图解说明。
[0043] 图5显示加热对HSA与缀合至式I的化合物的亲和琼脂糖材料的结合的影响和对相 同生物分子与Mime t i cB山e礙的结合的影响的比较。
[0044] 具体实施方案的发明详述 [004引定义
[0046] 本说明书和随附权利要求中所用的W下术语将具有指示的意思，除非上下文另有 规定：
[0047] DIPEA是指N，N-二异丙基乙基胺且也称为化nig碱
[0048] DMF是指二甲基甲酯胺
[0049] 邸TA是指N，N-乙二胺-Ν,Ν,Ν'，N'-四乙酸
[0050] HATU是指1-[二（二甲基氨基）亚甲基]-1Η-1，2,3-Ξ挫并[4,5-b]化晚鐵3-氧化物 六氣憐酸盐
[0051 ] h是指小时
[0052] HSA是指人血清白蛋白
[0053] MimeticRIue ?是指ProMetic BioSciences Ltd的Mimetic Blue" SA HL P6XL，如 W下所述（ www.prometicbiosciences.com/曰ssets/files/曰pp_notes/Mimetic%20Blue% 20SA% 20HL% 20P6)(L% 20Appl iation % 20Note % 20-% 20protein-f usion % 20protein % 20protein%20(091110)%20v2[l].p壯），MimeticBlue'i SA HL
[0054] min是指分钟
[005引 MSA是指小鼠血清白蛋白
[0056] NP40是指洗涂剂化巧itol-type NP-40,也称为壬基苯氧基聚乙氧基乙醇
[0057] 0D是指使用分光光度计测量的光密度，
[0058] 0D28日是指使用分光光度计在280nm测量的光密度，
[0059] PBS是指憐酸盐缓冲盐水
[0060] Pierce NHS-活化的琼脂糖是指N-径基班巧酷亚胺-活化的琼脂糖，如获自化ermo Scientific PexUProduct Cod 別25)，应用注解-使用Mimetic良lue?SA HL P閒L捕捉和 纯化重组白蛋白-融合蛋白。
[0061] 巧m是指每分钟的转数
[0062] 脚或的是指室溫
[0063] RSA是指大鼠血清白蛋白
[0064] SDS是指十二烷基硫酸钢 [00巧]TFA是指Ξ氣乙酸
[0066] 如本文所述，"烷基"是指任何脂族控取代基，其为直链或支链或环状的控或其组 合，其为完全饱和的。如本文所述，烷基也可是指单-或多不饱和的控，或其组合。饱和控取 代基的实例包括，但不限于W下已知的取代基：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正下基、叔下 基、异下基、仲下基、环己基、取代的环己基，W及例如取代或未取代的戊基、己基、庚基、辛 基取代基等的同系物W及位置异构体和立体异构体。烷基取代基，如本文所述，包括可具有 一个或多个双键或皇键的烷基取代基。
[0067] 如本文所述/'氨基烷基"是指在控中的一个或多个氨被氨基取代基 NHR、-NR2、-N=R、= NR等)取代的烷基取代基。
[0068] 如本文所述，"取代或未取代的氨基烷基"是指氨基烷基取代基可为-N此（未取代 的)或在氨基中的一个或多个氨原子被碳取代基取代，如W下所述:-NHR、-N = R、=NR等(取 代的）。
[0069] 如本文所述、"芳堂'是指任何芳香的控取代基如苯、糞、菲、巧、苯并[a]蔥、苯并 [a ]巧等，例如苯基、糞基、菲基等。如本文所述，芳基也包括杂芳基，包括任何完全或部分芳 香的杂环取代基。实例包括，但不限于，化咯、化晚、喀晚、嚷岭、化喃、巧喃、嚷吩、嚷挫、吗I 噪、咪挫、硫代咪挫、嗯挫、氮杂.葬、硫杂華(thiopene)、硫氮杂.華、哇嘟、氧杂聋、嗯二挫取 代基。
[0070] 如本文所述，"取代或未取代的芳基"是指在芳环上(苯基、糞基、菲基等)不具有除 氨W外的取代基的任何芳基取代基，或为其中一个或多氨被取代基取代的芳基取代基，该 取代基如碳(烷基等）、胺(氨基、氨基烷基、亚氨基、硝基、硝基烷基等）、硫(硫基、硫代烷基、 横酸醋基、硫酸醋基等）、氧代(幾基、醒、酸、醋、酸等）、面素(氯、氣、漠、舰)基团等。实例包 括但不限于苄基取代基，和甲苯、苯酪、苯胺、节腊、苯乙酬、苯甲醒、苯甲酸、二甲苯、和硝基 苯取代基。
[0071]如本文所述，"取代或未取代的杂芳基"是指如上所述的含有N、0或S的任何杂芳基 取代基，其中环碳上的一个或多个氨被取代。
[0072 ]本发明的实施方案提供了式I的化合物
[0073]
[0074] 或其盐，其中：r1为H、-Cl、-F、-Br、-I、-OH、-CN、-N02、取代或未取代的C广C6烷基、 取代或未取代的C1-C6締基、取代或未取代的环